样本保存液(带证,灭活型)公司正在出售的产品:大鼠肺动脉内皮细胞 葡萄糖苷2β/Glucosidase IIβ封闭多肽 金氏金氏菌PCR检测试剂盒 大鼠组织因子途径抑制物(TFPI)ELISA Kit αL阿拉伯呋喃糖苷(αLAf)比色法检测试剂盒 球盖蚁巢伞 FXYD离子转运调节因子7抗体
更新时间:2024-01-15
公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断!
货号 | 产品名称 | 规格 |
A-Tq3126 | 样本保存液(带证,灭活型) | 3ml/管,10管/盒 |
A-Tq3126 | 样本保存液(带证,灭活型) | 3ml/管,50管/盒 |
A-Tq3126 | 样本保存液(带证,灭活型) | 6ml/管,10管/盒 |
A-Tq3126 | 样本保存液(带证,灭活型) | 6ml/管,50管/盒 |
PCR基本步骤及注意事项?
一、实验原理
PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
二、主要的成分
1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。
注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。
2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。
PCR实验中应该注意的问题有哪些?
没有ct值
检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:
1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);
2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;
4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;
5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
ct值过晚
在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;
2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);
3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
公司正在出售的产品:
脑膜炎黄杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒 | C1q/TNF相关蛋白3ELISA试剂盒 Cartonectin/CTRP3/CORS-26免费代测试剂 | 玉米源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒 |
尼氏单孢子虫PCR检测试剂盒供应 | 泛蛋白连接E3成分N-识别蛋白4ELISA试剂盒 UBR4免费代测试剂 | 小反刍兽疫病毒PCR检测试剂盒供应 |
伽氏疏螺旋体探针法荧光定量PCR试剂盒 | 多巴胺受体D5ELISA试剂盒 | 库蚊通用探针法荧光定量PCR试剂盒 |
腺病毒PCR检测试剂盒 | 芳基硫酯HELISA试剂盒 | 口蹄疫病毒C亚型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒 |
牛蒡子探针法PCR鉴定试剂盒 | 分拣连接蛋白14ELISA试剂盒 | 人乳头瘤病毒52探针法荧光定量PCR试剂盒 |
脑膜炎奈瑟菌C群染料法荧光定量PCR试剂盒 | 封闭蛋白16ELISA试剂盒 | 欧洲放线菌探针法荧光定量PCR试剂盒 |
脑心肌炎病毒PCR检测试剂盒 | 钙蛋白12ELISA试剂盒 | 人类白细胞抗原A(HLA-A)基因染料法荧光定量PCR试剂盒 |
牛棒杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒 | 钙黏蛋白7ELISA试剂盒 | 焦槟榔染料法PCR鉴定试剂盒 |
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核检测试剂盒(RT-PCR) | 甘露聚糖结合凝集丝氨肽1ELISA试剂盒 | 人鼻病毒9 探针法荧光定量PCR试剂盒 |
脑心肌炎病毒PCR检测试剂盒 | 干扰调节因子1ELISA试剂盒 | 狂犬病病毒固定毒株PCR检测试剂盒 |
梅毒螺旋体核检测试剂盒 | 人α淀粉(AMY1)试剂盒ELISA | 人基质金属蛋白基因PCR检测试剂盒 |
马疱疹病毒4型探针法荧光定量PCR试剂盒 | 人Ⅷ相关抗原(Ⅷ-Ag)elisa试剂盒 | 紫花地丁染料法PCR鉴定试剂盒 |
着色霉探针法荧光定量PCR试剂盒 | 样本保存液(带证,灭活型)人G蛋白偶联受体152(GPR152/PGR5)ELISA检测试剂盒 | 马链球菌马亚种PCR检测试剂盒 |
脱氮副球菌PCR检测试剂盒 | 人丙型肝炎IgG(HCV-IgG)ELISA试剂盒 | 猪瘟病毒PCR检测试剂盒(荧光PCR法) |
人鼻病毒PCR检测试剂盒(荧光PCR法) | 人泛结合E2D1(UBC4/ 5的同源物,酵母)(UBE2D1)ELISA试剂盒 | 人疱疹病毒通用PCR检测试剂盒 |