Murine RNase Inhibitor公司正在出售的产品:人肝窦内皮细胞(永生化) CTAGE6蛋白封闭多肽 蜡状芽孢杆菌PCR检测试剂盒 大鼠可溶性血管细胞粘附分子1(sVCAM-1)ELISA试剂盒 蛋白质羰基活性比色法检测试剂盒 海科贝特氏菌 FBXW12蛋白抗体
更新时间:2024-01-12
商品属性:
产品名称 | 规格 | 货号 |
Murine RNase Inhibitor | 2000U | A-Hc2123 |
鼠核糖核酸酶抑制剂(Murine RNase Inhibitor)能够广泛抑制各种RNase (RNase A, B, C) 。它通过以1:1的比例以高亲和力非共价结合来抑制RNA酶。该抑制剂特异性抑制RNase A、B和C,不抑制真核 RNase T1、T2、U1、U2、CL3 以及原核 RNase I 和 RNase H。 Murine RNase Inhibitor经过 RT-PCR、RT-qPCR检验,能与多种商品化的如AMV、MMLV等逆转录酶以及Taq DNA Polymerase等DNA聚合酶兼容。Murine RNase Inhibitor不含半胱氨,具有更高的抗氧化活性,更适合于对高浓度DTT敏感的实验。
储存条件:-20℃保存
活性单位: 1个活性单位 (U) 定义为抑制5 ng RNase A活性的50%所需要的酶量。
质量控制:SDS-PAGE 检测纯度大于99%,经检测无核酸外切酶、核酸内切酶和核糖核酸酶活性,无细菌基因组DNA残留。
应用范围:
1.以RNA为模板的cDNA第一链合成。
2.RT-PCR、RT-qPCR
3.体外转录/转译系统。
4.需要包装RNA完整性的反应体系中。
储存缓冲液:20 mM HEPES-KOH,50 mM KCl,8 mM DTT,50% Glycerol,pH 7.6 @ 25°C。
注意事项:
1.高浓度的尿素,胍盐等蛋白变性剂作用下,Murine RNase Inhibitor会失活。
2.Murine RNase Inhibitor的使用量按照终浓度1U/μl添加。
3.Murine RNase Inhibitor应在可能导致RNase污染的其他成分之前加入反应中。
4.Murine RNase Inhibitor应在50°C以下使用。
PCR基本步骤及注意事项?
一、实验原理
PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
二、主要的成分
1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。
注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。
2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。
PCR实验中应该注意的问题有哪些?
没有ct值
检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:
1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);
2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;
4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;
5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
ct值过晚
在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;
2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);
3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
公司正在出售的产品:
人疱疹病毒6A型染料法荧光定量PCR试剂盒 | 单丝氨蛋白激1ELISA试剂盒 LIMK1免费代测试剂 | 金氏金氏菌染料法荧光定量PCR试剂盒 |
白蔹染料法PCR鉴定试剂盒 | 层黏连蛋白α4ELISA试剂盒 LAMα4免费代测试剂 | 人类嗜淋巴细胞病毒前病毒通用PCR检测试剂盒说明书 |
植物源性成分PCR检测试剂盒 | 皮稳定蛋白ELISA试剂盒 | 蜜蜂微孢子虫通用PCR检测试剂盒 |
产气荚膜梭菌C类磷脂基因(283bp)常规PCR检测试剂盒 | 超敏生长激ELISA试剂盒 | 蜜蜂球囊菌探针法荧光定量PCR试剂盒 |
螺源性成分染料法荧光定量PCR试剂盒 | 单纯疱疹病毒抗原2ELISA试剂盒 | 牛结节疹病毒探针法荧光定量PCR试剂盒 |
禽腺病毒(8b型)探针法荧光定量PCR试剂盒 | 蛋白O-葡萄糖基转移1ELISA试剂盒 | 转基因植物cry1A基因PCR检测试剂盒 |
禽腺病毒B型探针法荧光定量PCR试剂盒 | 蛋白3抗体ELISA试剂盒 | 疟原虫染料法荧光定量PCR试剂盒 |
罗斯肉瘤病毒PCR检测试剂盒 | 第10号染色体缺失并与张力蛋白同源的磷ELISA试剂盒 | 轮状病毒B组PCR检测试剂盒(荧光PCR法) |
路邓葡萄球菌PCR检测试剂盒 | 毒蕈碱型受体M5ELISA试剂盒 | 脑膜炎奈瑟菌PCR检测试剂盒(荧光PCR法) |
病毒通用型(AIV-U)核检测试剂盒 | 耳蝶呤1ELISA试剂盒 | 米黑根毛霉探针法荧光定量PCR试剂盒 |
苦参染料法PCR鉴定试剂盒 | 人高半胱氨(Hcy)ELISA检测试剂盒 | 牛腺病毒3型(BAV-3)PCR检测试剂盒(荧光-PCR法) |
七星库道虫探针法荧光定量PCR试剂盒 | 人肌钙蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)试剂盒elisa | 罗汉果探针法PCR鉴定试剂盒 |
鸭肠炎病毒染料法荧光定量PCR试剂盒 | 人凋亡抑制因子3(BIRC4/API3)ELISA试剂盒 | 脊髓灰质炎病毒通用型PCR检测试剂盒 |
马秋博病毒PCR检测试剂盒 | 人Smad1 试剂盒 ELISA | Murine RNase Inhibitor麦芽香肉杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒 |
猪流感病毒PCR检测试剂盒 | 人表面活性蛋白A(SP-A) ELISA Kit | 牛支原体PCR检测试剂盒 |