逆转录（reverse transcription），是以RNA为模板合成DNA的过程，合成的DNA称为cDNA。逆转录过程遗传信息的流动方向为RNA到DNA，与转录过程DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录。

一、实验原理要素：

酶促催化使RNA反转录为cDNA第一链。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与RNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。依据实验的不同目的，针对cDNA第一链合成的引物可根据特殊的靶基因设计，或可用随机引物与所有mRNA杂交。

实验要素：

逆转录实验包括3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板：

1. 引物：

逆转录引物主要有3种，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特异性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20个 T 碱基，并且与真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配对，可合成全长的 cDNA，但仅扩增有 polyA 尾的 mRNA ，对模板质量要求高，较适合克隆实验。而 Random Primers 具有6-9个碱基，可随机识别模板并结合，适合复杂结构和微量模板，但特异性低，小片段多，适合后续 qPCR 实验。基因特异性引物可以识别特定模板序列，具有特异性强，灵敏度高的特点，但需合成特定的序列。所以根据不同实验需求可进行相应引物的选择。

2. 逆转录酶：

一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的 RNaseH 活性，它最适温度是42℃，最适 pH8.3，在高反应温度时可消除 mRNA 的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 产生也限制其长度。另一种来源于鼠白血病病毒（M-MLV），是单肽链的，有 RNA 聚合酶活性和相对较弱的 RNaseH 活性，最适温度37℃，最适 pH7.6，较弱的  RNaseH 活性对获得2-3kb的 mRNA 的全长 cDNA 有很大好处。

3. RNA 模板：

通常利用紫外分光光度计检测纯度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整度，完整的总 RNA 在进行琼脂糖凝胶电泳时会产生清晰的28S 和18S rRNA 条带（真核样品），28S rRNA  条带的强度应当大致为18S rRNA 条带的两倍，并且无 gDNA 和蛋白残留。

二、实验流程：

1. 实验前准备

RNA样品、逆转录试剂盒（以诺唯赞R312为例）

2. 实验步骤

① 试剂化冻后，用手轻弹混匀后短暂离心。

② 基因组DNA（gDNA）去除：根据RNA样品的浓度按10pg~1μg计算用量，在RNase-free离心管中依次加入RNase-free ddH2O，5×gDNA Wiper Mix 2μL，RNA样品，总体系为10μL。用移液器吹打混匀后短暂离心。放入PCR仪，设置反应条件为42℃ 2min。

③ 第一链cDNA合成：根据上一步反应管的数量按以下体系在RNase-free离心管中配制预混液：RNase-free ddH2O 5μL，逆转录引物（2μM）1μL，10×RT Mix 2μL，HiScript II Enzyme Mix 2μL，用移液器吹打混匀后短暂离心。在上一步得到的反应管中每管加入10μL，用移液器吹打混匀后短暂离心。放入PCR仪，设置反应条件为25℃ 5min，50℃ 15min，85℃ 5min。所得cDNA产物可立即用于qPCR反应或-20℃保存。

三、注意事项：

1. 防止RNase污染：保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase-free。

2. 反应液的配制要在冰上操作完成，防止温度过高造成RNA降解。

3. cDNA保存时避免反复冻融。

四、常见问题：

1. 逆转录后的产物可以测浓度吗？

不建议测浓度，一般评估RNA模板的质量，需要从浓度、纯度及完整性三方面进行考量，但逆转录后的产物是一个混合体系，有cDNA、未全逆转录的RNA、dNTP、残余的引物以及各种蛋白和盐离子等成分，会干扰cDNA的吸光度，因此不建议用逆转录后的cDNA来检测浓度与纯度。

2. 如何检测RNA逆转录成功与否？

1) 内参法：理论上，逆转录的cDNA是长度不同的DNA片段，所以电泳条带应该均匀分布在泳道上，如果RNA丰度低，电泳检测也可能无产物，这种情况通过PCR扩增内参基因，如果有扩增产物，cDNA的质量基本上可以保证(少数情况下：如目的基因片段过长，可能会有例外)。

2) 已知基因扩增法：如果有已知以此模板扩出来的基因，可以用此基因的引物验证。能扩增出内参，不一定就说明cDNA没有问题，因为内参在cDNA中丰度高，容易扩增。如果cDNA因为各种原因导致部分降解，则会大大影响低丰度的目的基因的PCR结果，而内参因为是高丰度基因，扩增很可能不受影响。

3. 逆转录产物中存在gDNA对后续qPCR实验有何影响？

当cDNA产物中混有gDNA时，cDNA和gDNA在qPCR反应时会被同时扩增，无法区分荧光信号是来自于cDNA还是gDNA，因此定量结果可能会存在偏差。特别是低表达量的基因，本身的扩增信号低，Ct值大，更加容易受到gDNA污染的影响。在逆转录的时候，加一步gDNA去除的步骤，能够有效降低gDNA污染的影响，增加实验的可信度。