ELISA又称酶联免疫吸附测定，是定量检测体液中各种靶标蛋白含量的常用方法。其呈色反应可进行定性或定量分析，利用HRP酶催化TMB，反应产生蓝色亚胺溶液，加入终止液后，使蓝色阳离子转变为黄色的联苯醌。除了常见的蓝色和黄色，ELISA实验过程中，也会出现一些不同寻常的多样色彩。

一、墨绿色 / 深蓝色

例：加入底物溶液孵育后，酶标板孔溶液变成墨绿色或深蓝色。

在正常的ELISA实验中，加入底物溶液孵育后，标曲前四孔出现明显蓝色梯度，即可终止反应。但是，当孵育的HRP酶结合物工作液浓度过高，或样本浓度远高于检测范围时，标曲最高1-2个梯度孔或样本孔可能会呈现墨绿色或深蓝色。

墨绿色样本终止反应后，在450nm波长下读取的OD值可能会比实际要低；深蓝色标曲会由于梯度OD值过于接近，无法拟合得到有效标曲并准确计算样本浓度。

建议：

（1）严格控制每一步的孵育温度和时间，按照说明书要求制备HRP酶结合物工作液；

（2）在显色阶段，通过前四孔出现明显蓝色梯度来控制显色时间；

（3）浓度过高的样本需要稀释到试剂盒检测范围内，再进行测定。

二、黄色

例：终止反应后，整板变成黄色。

可能原因：

1 竞争法按照夹心法操作：两者原理不同，操作步骤不同，请注意区分。

2 洗涤不当：甩板时离废液桶太近，导致液体反溅；甩板不干脆，导致液体残留或流入其他孔；洗涤时每孔注入的洗液不够，或洗涤次数不够；液体过多溢出污染；浸泡时间过短；

3 显色剂保存不当，或孵育时未避光，造成非特异性显色；

4 孵育温度过高，或孵育时间过长；

5 不同试剂盒组分混用或替代，产生基质效应或非特异性吸附，导致假阳性结果。

三、标曲正常，样本孔全黄

读值计算后，发现标曲拟合效果良好，但样本OD超过标曲最大OD，表明样本还需要稀释哦。

四、 黑色

例：加入终止液后，酶标板孔中液体变黑，或产生黑色沉淀。

可能原因：

1、HRP酶浓度过高：准备HRP酶工作液时，保证计算和配制体积准确，按照说明书中的洗涤体积、时间、次数进行洗板；

2、样本中指标浓度过高，样本还需要稀释；

3、终止液中硫酸浓度过高或变质：终止液是1M H2SO4，混用过高浓度的硫酸可能导致炭化反应。