浅述荧光定量PCR试剂盒的操作方法
点击次数：541 更新时间：2021-03-10
一、病毒DNA的提取
1、取出已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600/L抽提液（用抽提液之前不要晃动，不要吸到上层保护液），用力颠倒10次混匀，12,000rpm离心10min。
2、取500/L上清置于灭菌离心管中，加入500/L异丙醇，混匀，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出样品管，室温融化，13,000rpm离心15min。
3、弃上清，沿管壁缓缓加入1mL洗涤液，轻轻旋转一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，再将离心管真空抽干15min或37℃烘干。
4、用30/L无菌水溶解沉淀，作为模板备用。
二、样品制备
1、样品采集：病死或扑杀的猪，取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、扁桃体、淋巴结等组织；待检活猪，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于50%甘油生理盐水中，或用注射器取血5mL，2～8℃保存。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）
2、样品处理：
（1）组织样品的处理：称取组织0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心5min，取上清100/L于1.5mL灭菌离心管中，加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。
（2）全血样品的处理：待血凝后取血清放于离心管中，8000rpm离心5min，取上清100/L于1.5mL灭菌离心管中，加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。
（3）阳性对照的处理：混匀后取100/L于1.5mL灭菌离心管中，加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。
（4）阴性对照的处理：混匀后取100/L于1.5mL灭菌离心管中，加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。
三、PCR
1、反应体系：分别取16/LPCR反应液A（用前混匀）、2/LPCR反应液B（用前混匀）和2/L模板DNA，混匀。
2、反应程序：在PCR仪上运行以下程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。
四、电泳
1、制胶：用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。
2、电泳：待胶凝固后，取5/LPCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm的电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳。
3、染色：取50倍稀释的TAE电泳缓冲液30mL，加入10/L染色液，混匀后将胶浸泡30min，于紫外灯下观察结果。
