一文与您分享基因探针法PCR试剂盒的正确使用方法
点击次数：14 更新时间：2026-02-02
基因探针法PCR试剂盒是分子诊断、病原检测、基因表达分析及转基因鉴定的核心工具，通过序列特异性引物与5'端标记荧光、3'端标记淬灭基团的水解探针，实现高特异性、高灵敏度。若操作不当，易导致假阳性、假阴性、扩增效率低或Ct值漂移。
基因探针法PCR试剂盒应遵循防污染、精配液、严操作、准分析的原则，是确保结果真实可靠的关键。
一、实验前准备
严格分区操作：
设立独立区域：试剂配制区→样本处理区→扩增区，单向流动，禁止交叉；
使用带滤芯吸头、专用移液器及实验服，所有耗材无DNA/RNA酶；
试剂解冻与混匀：
将MasterMix、引物/探针、内参等试剂从–20℃取出，室温避光解冻；
轻柔涡旋混匀，瞬时离心去除管壁液体，避免反复冻融（建议分装使用）。
二、反应体系配制
推荐20μL体系示例：
2×TaqManMasterMix：10μL
正向/反向引物（10μM）：各0.4–0.8μL
探针（10μM）：0.4μL
模板DNA/cDNA：1–5μL（浓度适中，避免抑制剂残留）
无核酸酶水补足至20μL
操作要点：
先配制主混合液（MasterMix+引物+探针+水），再分装，减少加样误差；
模板加入，加样后立即盖紧管盖，防止气溶胶污染。
三、上机运行与程序设置
标准qPCR程序：
预变性：95℃30秒（激活热启动Taq酶）；
循环40–45次：95℃5秒→60℃30–60秒（采集荧光信号）；
熔解曲线（如需）：不适用于TaqMan探针法（因探针水解不可逆），仅用于SYBRGreen法。
四、结果判读与质控
有效判定标准：
阴性对照（NTC）无扩增曲线（Ct>40或未检出）；
阳性对照Ct值在预期范围内（如20–25）；
内参基因Ct稳定（样本间差异≤1个Ct）；
定量分析：
采用ΔΔCt法或标准曲线法，确保扩增效率90–110%（斜率–3.1～–3.6）。
