T4 UvsX Recombinase

商品属性：

描述:

UvsX 重组酶，来源于 T4 噬菌体，是 RecA/Rad51家族的同源体。RecA/Rad51 重组酶家族在双链 DNA 断裂的无误修复和复制叉重新启动的过程中起到重要作用。
T4 UvsX 重组酶可与其他重组酶一起锚定在单链 DNA 上并激活其在其他双链 DNA 上寻找同源序列，以进一步完成链置换。经检测，该酶无核酸酶活性。

储存：

置于-20°C 可保存 1 年，-80°C 长期保存，短期使用置于 4°C，保存一个月，避免反复冻融。
热失活：60°C，10min。
酶储存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM
EDTA, 10% Trehalose, pH 7.5。2xRPA BufferMix：包含反应缓冲盐、ATP、磷酸肌酸、dNTP、PEG、DTT、BSA 等，可用于 RPA 扩增试验。该试剂 4°C
条件下放置 1 个月性能无下降。
基于本蛋白进行 RPA 反应测试的全套试剂

用于 RPA 扩增的测试引物与探针
CPV-F（20uM） CACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAG
CPV-R（20uM） AGTTTGTATTTCCCATTTGAGTTACACCACGTCT
Probe（10uM） CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGT[dT-BHQ1]
[THF][dT-FAM]ATAGGAGTTCAACAAG -(C3)
Canine parvovirus type 2,VP2
加入 1μl 的模板 DNA，上机反应前加入 1.25 μl 的 280 mMMg(OAC)2（终浓度 14 mM），总反应体积 25 μl。混合均匀，并离心，置于 39-42℃条件下反应 30min。
2. 进行荧光 RPA 扩增在进行荧光检测时体系中，额外加入 0.3 μl 的 10μM Probe（120 nM的终浓度）和 50U 的 Exonuclease III（2U/μl 的终浓度），即可进行荧光检测。本方法应用原理为 ExoIII 切割 THF 位点，使荧光与猝灭基团分离，报告荧光信号。
特别说明：
（1） 以上 RPA 扩增测试属于蛋白功能性测试，按照以上实验操作流程，可获得 RPA 扩增产物。进一步的优化，包括：X、Y、GP32、聚合酶、反应 Buffer，甚至加样顺序，均可能进一步提高 RPA 的扩增性能。
（2）关于 DNA 聚合酶的选择， 测试了三种常见的 DNA聚合酶，在进行荧光法测定时，推荐的选择顺序依次为 Bst 4.0>Bsu> Sau，且在 42℃条件下，总能获得最快的扩增速度，且荧光信号更强。在 Basic 扩增中 Sau 表现出特异性扩增能力更佳。
（3）关于 RPA 的灵敏度与非特异扩增，在 Basic 试剂的扩增中，仍然存在非特异扩增产物，这需要进一步优化反应组分及引物序列。在使用荧光探针法时，但由于特异性探针的存在，非特异扩增产物通常无荧光信号值，但此时会影响检测灵敏度。GP32 蛋白的
浓度增加会显著降低非特异性扩增，但会导致扩增速度减缓，此时需要同步增加 X 与 Y 蛋白的用量，以维持 RPA 的扩增速度。
（4）据文献报道，在进行试纸条 RPA 实验时，倾向使用 Nfo 内切酶又名 Endonuclease IV， 来对扩增探针进行切割，但  未予测试，目前无法提供相应参数。
（5）RPA 反应 Buffer 对扩增至关重要，轻微的浓度差异，均可导致扩增效率大幅下降，甚至失败。RPA BufferMix 为粘稠试剂，使用时务必保证加样准确，Tip 头中的残液务必打入 EP 管中。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

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