RAPA3G SYBR Green qPCR Mix

商品属性：

本制品是采用 SYBR Green 嵌 合 荧 光 法 进 行Real-Time PCR 的专用试剂，本 SYBR Green qPCR Mix将化学修饰的热启动 RAPA3G DNA 聚合酶、反应 Buffer、dNTP、SYBR Green 染料等试剂预混在一起，是一种 2×浓度的单组分预混试剂。该制品配有单独的 ROX 内参染料，可用于需要 ROX 进行孔间校正的定量 PCR 仪。RAPA3G DNA 聚合酶为第三代 DNA 聚合酶，其具有最高的杂质耐受性（对乙醇、胍盐、肝素具有高的耐受性），因此对于纯度较差的 DNA 模板，该 Mix 仍然可以获得理想的实验结果。RAPA3G DNA 聚合酶为化学法修饰的 HotStart版本，其在 50℃以下 100%无活性，只有 95℃条件下加热5min 后才能恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性 PCR 扩增，极大的提高了 PCR 扩增特异性。该试剂盒的反应缓冲液，可在宽范围中得到良好的扩增结果、检测灵敏度更高、信号更强。
包装
规 格
2×RAPA3G SYBR
Green qPCR Mix
50×ROX Dye
1ml （A2250A） 1 ml 200 μl
5ml （A2250B） 1 ml×5 200 μl
储存：
请避光置于-20℃以下可保存３年。该试剂经 30 次冻融后性能无下降，因此不使用时请置于-20℃避光保存。
操作方法
1. 根据机型选择步骤 A 或 B
A: 需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的 Real-TimePCR 仪，包括：ABI PRISM7900HT, 7300/7500/7500 FastReal-Time PCR (Applied Biosystems)；Mx3000P(Stratagene)等。按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系：终浓度
2×RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×
50×ROX Reference Dye 0.4 μl 1×
PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
注意：引物用量有时可提高到 0.8 μl 以提高扩增效率。B:无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的 Real-TimePCR 仪，包括：LightCycler (Roche Diagnostics)； CFX96Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene等。按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系：终浓度
2×RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×
PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法，程序如下：
 Stage 1: 95℃ 5min*
 Stage 2: 95℃ 10s
60℃ 20s 40 cycles
 Stage 3: Dissociation analysis
注意：由于该酶为化学修饰的热启动 RAPA3G DNA 聚合酶，必须于 95℃加热 5min 才能恢复酶的活性，该热启动步骤不能缩短时间。
3. 反应结束后确认 Real-Time PCR 的扩增曲线、融解曲线和标准曲线。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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