2XRAPA HiFi PCR Mix(with dye)

商品属性：

RAPA HiFi DNA 聚合酶，其来源于高保真 DNA 聚合 酶，并加入了增强的延伸结构，使其具有超保真性能（~280 倍 Taq）、长片段扩增能力、高产量。长片段扩增能力，使用 该酶可轻松扩增 8kb 的基因组 DNA、20kb 的λ DNA、8kb 的 cDNA。该酶具有 6kb/min 以上的延伸速度。该 PCR Mix 具有 5’-3’的聚合酶活性、强 3’-5’的外切酶活性，产物为平末 端。该制品中已经含有溴酚蓝染料，PCR 扩增完毕后可直接 点样于琼脂糖凝胶，无需再加入 DNA Loading Buffer。

特点和用途
(1) 超保真扩增：~280 倍 Taq 的保真性能，是载体构建、点突变、NGS 模板扩增、基因合成的最佳用酶。
(2) 快速扩增：具有 6kb/min 的扩增能力。
(3) 长片段扩增：质粒、λDNA 等简单模板可以有效扩增>20 kb，基因组可以有效扩增>8 kb，cDNA 可以有效扩增>8kb。
储存：长期储存置于-20°C 以下，可保存 2 年；短期使用置于 4°C（3 个月）保存。
使用方法
1. 按下表配制反应体系并混合均匀：
2×RAPA HiFi PCR Mix 12.5 μl
上游引物(10 μM) 1 μl
下游引物(10 μM) 1 μl
模板 DNA 1-250 ng
ddH2O up to 25 μl
*模板 DNA 用量参数(25 μl 反应体系)
5-250 ng Genomic DNA
0.1-10 ng Plasmid DNA
1-2 μl cDNA from RT reaction
2. PCR 扩增循环参数
（1）扩增片段<5kb 时采用如下程序
循环数 温度 时间
1st Cycle 95°C 1min
25-35 Cycles
95°C 30s
50~60°C 30s
72°C 6kb/min
Last Cycle 72°C 2min
（2）扩增片段>5kb 时采用如下程序
循环数 温度 时间
1st Cycle 92°C 1min
25-35 Cycles
92°C 30s
50~60°C 30s
72°C 2-3kb/min
Last Cycle 72°C 2min
3. 电泳：1% 琼脂糖凝胶电泳，上样 5 μl，电泳结束在紫外灯下检测条带。
4. 注意事项：（1）当模板 GC 含量>65%时，请添加
5× Q-Solution（Cat. No.: A3002）。（2）当扩增片段<1kb>5kb 时，按照2-3kb/min 的延伸时间进行设置，能获得更高的产量。（3）由于不同的 PCR 管其导热性能有所不同，通常 PCR 采用25μl 体系可以获得更高的产量。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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