Dnase I(Rnase free)公司正在出售的产品:人肺癌细胞 S状病毒2 Spike蛋白S1(A570D)突变多肽 泰泽隐孢子虫PCR检测试剂盒 大鼠糖原磷化同工II(GP-II)ELISA Kit 土壤N乙酰βD葡萄糖苷(SNAG)活性比色法检测试剂盒 噬纤维菌 腱糖蛋白R抗体
更新时间:2024-01-14
公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断!
货号 | 产品名称 | 规格 |
A-PJ1121 | Dnase I(Rnase free) | 1000U |
该酶是将单链或双链 DNA 同等程度的随机分解,生成具有 5′-P 末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。由于RNase-free DNase I 中 Protease 已几乎被去除,从而提高了该酶在 pH 中性区域的稳定性。此外该酶中添加了
Rnase Inhibitor,用于抑制 RNA 样品中残留的 RNase 核酸酶,因此可以有效抑制 RNA 提取过程中 Rnase 酶对 RNA的降解。Stop Buffer 终止反应后,可通过一步加热失活DNase I 活性。
活性定义
在 50 μl 体系下,37℃ 10min 条件下消化 1 μg pBR322质粒 DNA 所需的酶量定义为 1 个活性单位。纯度
2 U 的本酶和 1 μg 的 16S, 23S rRNA 在 37℃、pH7.5 的条件下反应 1 小时,RNA 的电泳谱带不发生变化
应用:去除 RNA 样品中的 DNA 污染。
储存:-20°C 可保存 2 年。
操作方法(去除 RNA 中的基因组 DNA 污染)
1. 按以下组分配制反应体系
RNA 1~50 μg
10× RD Buffer 2 μl
Rnase Free DNase I (2 U/μl) 1 μl*
Rnase Free H2O Up to 20 μl
*若 RNA 样品中含有超过 5 μg 基因组 DNA 污染,请使用2 μl 该酶。
2. 37°C 孵育 15min 以消化去除基因组 DNA。
3. 孵育完毕后加入 2 μl 10× RD Stop Buffer,混合均匀室温放置 1min,并置于 75°C 10min 加热失活 DNase I。样品可直接用于下一步反转录等试验。
注意:
1)通常加热方法即可失活 DNase I。如需要去除残留的变性蛋白,可在 37°C 消化完毕后使用酚氯仿抽提并沉淀 RNA样品(不进行加热操作)。
2)10× RD Stop Buffer 中含有螯合剂用于去除二价阳离子,进行加热失活前,必须加入 2 μl 10× RD Stop Buffer 并混合均匀,再进行热失活,否则会导致 RNA 降解。
3)处理完毕的 RNA 样品进行一步反转录反应时,添加量需要<20%(如 20 μl 的反转录体系中加入量要<4 μl)
PCR 反应需要使用哪些试剂和设备?
试剂:
模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物;
设备:
PCR仪:用于控制反应温度,保证PCR反应时不同温度环节的严格控制;电泳槽:用于分离PCR扩增产物;核酸提取仪:从组织样本中全自动提取核酸。 这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是,只有在有序齐全的基础上,才能进行PCR反应并得出准确结果。
PCR相关基础实验:
PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:
一、变性:
利用高温(93-98℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。
二、退火或称接合,复性:
在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。
三、延伸:
DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。
PCR反应条件优化:
1、变性温度和时间:
保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s,再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,小于1kb, 1min足够;大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意,延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%,因此不管模板浓度是多少,20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多,非特异扩增增加。
公司正在出售的产品:
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