UNG (Uracil N-Glycosylase)公司正在出售的产品:小鼠诱导型多能干细胞 蛋白磷2Cα封闭多肽 马克洛菌PCR检测试剂盒 大鼠糖皮质激受体β(GR-β)试剂盒 ELISA 糖原磷化a(GPa)活性比色法检测试剂盒 独岛藏红花色纤细杆菌 透明质及粘蛋白2抗体
更新时间:2024-01-14
商品属性:
产品名称 | 规格 | 货号 |
UNG (Uracil N-Glycosylase) | 1000U | A-PJ1116 |
UNG (Uracil N-Glycosylase) | 5000U | A-PJ1116 |
niao嘧啶 DNA 糖基酶(Uracil N-Glycosylase,UNG)又名 Uracil-DNA Glycosylase, UDG, 来源于 E. coliuracil N-glycosylase 基因的重组表达,分子量为 26kDa。其可催化含niao嘧啶的单链和双链 DNA 释放游离niao嘧啶。
它对 RNA 无活性,主要应用于 PCR 扩增产物的防污染。
它的作用原理基于:如果在 PCR 反应中以 dUTP 替代dTTP掺入DNA 中,形成了含 dU 碱基的 PCR 扩增产物,该酶能选择性断裂单链和双链 DNA 中 U 基的糖苷键,降解该 PCR 扩增产物。
活性定义:在标准 PCR 反应体系下,37℃条件下,1 小时降解 1μg 含 dU 碱基的单链 DNA 的酶量为 1 活性单位。
反应 Buffer:UNG与绝大多数的PCR 聚合酶反应缓冲液都是兼容的,但在高离子浓度(>100mM)下活性会受到抑制。
酶储存液:20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, , 50%Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。
储存:置于-20°C 可保存 2 年,避免反复冻融。
热失活:95°C,5min。
操作方法
1.配制反应体系
Super Taq DNA Polymerase 0.5 μl
dNTP/dUTP Mixture 2~4 μl
10XHi PCR Buffer 5 μl
Uracil N-Glycosylase (5U/μl) 0.2~0.5 μl
Primers (10μM each ) 1 μl
Template DNA 10 ng-1 μg
DEPC-treated Water up to 50 μl
2. PCR 扩增循环参数
循环数 温度 时间
去污染 50°C 2min
热失活 95°C 5min
30-40 Cycles
95°C 20s
50~60°C 20s
72°C 1kb/1min
Last Cycle 72°C 5min
PCR基本步骤及注意事项?
一、实验原理
PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
二、主要的成分
1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。
注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。
2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。
PCR实验中应该注意的问题有哪些?
没有ct值
检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:
1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);
2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;
4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;
5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
ct值过晚
在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;
2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);
3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
公司正在出售的产品:
猪肠道杯状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒 | β胶原交联ELISA试剂盒 bCTx免费代测试剂 | 人腺病毒D102型探针法荧光定量PCR试剂盒 |
嗜皮菌PCR检测试剂盒价格 | 蛋白酪氨磷受体GELISA试剂盒 PTPRG免费代测试剂 | 巨球菌PCR检测试剂盒直销 |
登革热病毒通用型(DFV-U)核检测试剂盒 | 细胞色b-561ELISA试剂盒 | 马媾疫锥虫PCR检测试剂盒 |
蓝舌病毒PCR检测试剂盒 | 的神经生长因子ELISA试剂盒 | 马杜拉分枝菌染料法荧光定量PCR试剂盒 |
猫衣原体探针法荧光定量PCR试剂盒 | 短腭肺鼻腔上皮癌关联蛋白2ELISA试剂盒 | 粪肠球菌探针法荧光定量PCR试剂盒 |
皮炎外瓶霉染料法荧光定量PCR试剂盒 | 多肽-N-乙酰氨基半乳糖转移4ELISA试剂盒 | 河弧菌(VF)核检测试剂盒 |
皮炎芽生菌PCR检测试剂盒 | 二氢二醇脱氢ELISA试剂盒 | 禽传染性支气管炎病毒疫苗株探针法荧光定量RT-PCR试剂盒 |
猫衣原体PCR检测试剂盒 | 泛醌蛋白2ELISA试剂盒 | 蓝氏贾第鞭毛虫A型探针法荧光定量PCR试剂盒 |
猫嗜衣原体PCR检测试剂盒 | 防御α6ELISA试剂盒 | 欧雅病毒核检测试剂盒 |
诺氏梭状杆菌PCR检测试剂盒 | 分拣连接蛋白17ELISA试剂盒 | 马炎病毒探针法荧光定量PCR试剂盒 |
流行性出血热病毒PCR检测试剂盒价格 | 人单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSVⅠ)抗体(IgM)ELISA检测试剂盒 | 禽副粘病毒2型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒 |
啮蚀艾肯菌PCR检测试剂盒供应 | 人肌细胞生成(MYOG)试剂盒elisa | 柏氏血矛线虫探针法荧光定量PCR试剂盒 |
人附红细胞体(人嗜血支原体)染料法荧光定量PCR试剂盒 | 人白介6受体(IL-6R)ELISA试剂盒 | 里氏立克次氏体PCR检测试剂盒 |
海豹分支杆菌PCR检测试剂盒 | 人β血小板球蛋白/β血栓环蛋白(β-TG)ELISA Kit | UNG (Uracil N-Glycosylase)山羊附红细胞体探针法荧光定量PCR试剂盒 |
驴源性成分(Don)核检测试剂盒 | 人存活抗体/生存蛋白(Surv)ELISA检测试剂盒 | 病毒H7N9亚型(AIV-H7N9)核检测试剂盒 |