组织细胞microRNA提取试剂盒

商品属性：

描述：生产的组织细胞 miRNA 提取试剂盒是目前世界 上提取小 RNA（<200nt）操作步骤重复性最好、 小 RNA 产率最高的方法。使用该试剂盒提取的小 RNA （Small RNA）中，长度在 15～200nt 范围的 RNA 在 95% 以上，基本不含有大 RNA 和 DNA。使用该试剂通过一步上 柱即可获得高纯度 miRNA，可在 45min 内完成小 RNA 的提 取。该试剂盒广泛适用于动物组织、细胞和多糖多酚含量不 高的植物组织样本。

储存：室温可保存 2 年。

使用防护建议：miRNA Reagent A 溶液中含有胍盐，其具有 强烈的腐蚀性，试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等 防护措施，如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗，再另行就 医。

操作方法： 1. 组织样本提取 (1) 向 1.5ml EP 管中加入 300μl miRNA Reagent A。植物组 织则再加入 10μl β-巯基乙醇，混合均匀。 (2) 在液氮条件下充分将组织研磨粉碎，将一定的样品量（见 样本使用量表）研磨成粉状的组织加入到上述 300μl miRNA Reagent A 中，立即手腕用力震荡至组织粉末溶解于裂 解液中。室温静置 5min 以充分裂解细胞。 注意：将组织加入到 miRNA Reagent A 后要迅速将组织震散，否 则易引起组织成团状，不容易裂解。如发生成团状，务移液器 将团状组织吹打松散。 (3) 向上述裂解完毕的裂解液中加入 350μl miRNA Reagent B，上下颠倒混合均匀。13,000rpm 离心 5min，吸取 550μl 上清液，转移到新的 1.5ml EP 管中。 (4) 向上述溶液中加入 200μl 无水乙醇，手腕用力震荡数次， 室温放置 5min。 (5) 13,000rpm 离心 10min，转移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。 (6) 向上述溶液中加入 300μl 异丙醇，手腕用力上下颠倒数 次。 (7) 分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (8) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (9) 向吸附柱中加入 500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (10) 吸附柱 13,000rpm 空离心 2min，去掉残留的乙醇。 (11) 将吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室温放置 2min，使 残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入 30μl RnaseFree TE Buffer，室温静置 2min，13,000rpm 离心 2min，洗脱产物 即为提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 该产物，即可使用 一步法 miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应，

2. 细胞样本提取 (1) 贴壁细胞：消化细胞后，离心收集细胞沉淀。用 100μl 1×PBS 重悬细胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 颠倒混 合均匀，室温放置 5min。 (2) 悬浮细胞：直接离心后，收集细胞沉淀。用 100μl 1×PBS 重悬细胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 颠倒混合均匀， 室温放置 5min。 (3) 向上述裂解完毕的裂解液中加入 250μl miRNA Reagent B，上下颠倒混合均匀。13,000rpm 离心 5min，吸取 550μl 上清液，转移到新的 1.5ml EP 管中。 注意：加入细胞体积数与 miRNA Reagent B 总体积数为 350μl。如加入 50μl细胞，则 miRNA Reagent B使用 300μl。 (4) 向上述 550μl 上清溶液中加入 200μl 无水乙醇，手腕用 力震荡数次，室温放置 5min。 (5) 13,000rpm 离心 10min，转移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。 (6) 向上述溶液中加入 300μl 异丙醇，手腕用力上下颠倒数 次。 (7) 分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (8) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (9) 向吸附柱中加入 500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (10) 吸附柱 13,000rpm 空离心 2min，去掉残留的乙醇。 (11) 将吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室温放置 2min，使 残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入 30μl RnaseFree TE Buffer，室温静置 2min，13,000rpm 离心 2min，洗脱产物 即为提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 该产物，即可使用 一步法 miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应，。

常见问题汇总： (1) 本方法提取的小 RNA，95％以上为小 RNA（200nt 的 RNA，通常残留的>200nt RNA 不影响后续试验操作。 (2) 本试剂盒提取的小 RNA 由于不含 mRNA 等大分子量的 RNA，因此更适合做后续反转录试验，从而进行定量试验。 (3) 使用本试剂盒提取的 miRNA 浓度通常在 50ng/μl 左右， 取 5～10μl 即可用于电泳检测。取 1~2μl 即可用于 HG TaqMan miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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