HG TaqMan miRNA定量PCR试剂盒公司正在出售的产品:犬肾细胞系 白细胞介-18受体β链封闭多肽 毛样枝孢霉PCR检测试剂盒 大鼠肾上腺髓质(ADM) ELISA检测试剂盒 脯氨脱氢(ProDH)活性比色法检测试剂盒 潮间带杆菌 CWF19L1蛋白抗体
更新时间:2024-01-12
描述:HG TaqMan miRNA 定量PCR 试剂盒, 采用特异性的正向 miRNA 引物和接头引物进行 PCR 扩 增,检测荧光基团采用 FAM 标记的特异性 miRNA TaqMan 探针(原理见图 1)。使用该试剂盒可以特异性、 高灵敏度的检测低至 100 个细胞的 miRNA 分子。 的 TaqMan miRNA 定量 PCR 试剂盒共有一万 余种,每一个 mircoRNA 分 子对应一个检测试剂盒(包含特异性的 TaqMan 探针、正 向引物、反向引物、定量试剂),可在 HG TaqMan miRNA qPCR kit.xls 中查询。如果您研究的 mircoRNA 分子不在 我们的列表中,请来信咨询,我们将及时给您优化设计。 内参基因可选择使用: (1)TaqMan RNU6B miRNA 定量 PCR 试剂盒适用于人、鼠等哺乳动物组织、细胞样品; (2)TaqMan hsa-miR16 miRNA 定量 PCR 试剂盒适用于来源于人、鼠全血样品。
组分:
储存:避光置于-20°C,可保存 2 年;避免反复冻融
1 配制反应体系(20μl)
5×Golden HS TaqMan qPCR Mix 4 μl
20×miRNA TaqMan Assay 1 μl
*cDNA 模板 1~2.5 μl
ddH2O Up to 20 μl
2 进行 Real-Time PCR 反应
通常采用两步法,程序如下:
Stage 1: 95℃ 15 min(热启动,不可缩短时间)
Stage 2: 95℃ 10 s
60℃ 30 s 40cycles
(收集信号采用 FAM 染料通道,Rox 矫正信号选择 None)
3 反应结束后确认 Real-Time PCR 的 cDNA 样品和 NTC
阴性对照的扩增曲线。
公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断!
货号 | 产品名称 | 规格 |
A-PJ1083 | HG TaqMan miRNA定量PCR试剂盒 | 100TX20μl |
PCR 反应需要使用哪些试剂和设备?
试剂:
模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物;
设备:
PCR仪:用于控制反应温度,保证PCR反应时不同温度环节的严格控制;电泳槽:用于分离PCR扩增产物;核酸提取仪:从组织样本中全自动提取核酸。 这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是,只有在有序齐全的基础上,才能进行PCR反应并得出准确结果。
PCR相关基础实验:
PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:
一、变性:
利用高温(93-98℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。
二、退火或称接合,复性:
在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。
三、延伸:
DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。
PCR反应条件优化:
1、变性温度和时间:
保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s,再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,小于1kb, 1min足够;大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意,延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%,因此不管模板浓度是多少,20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多,非特异扩增增加。
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