血清血浆microRNA提取试剂盒

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

描述：血清血浆 miRNA 提取试剂盒是目前提取小 RNA（<200nt）操作步骤简单、重复性最好、小 RNA 产 率最高的方法之一。使用该试剂盒通过一步上柱即可获得高 纯度 miRNA，可在 10min 左右完成小 RNA 的提取；且使用 该试剂盒提取的小 RNA（Small RNA）中，长度在 15～200nt 范围的 RNA 在 95%以上，基本不含有大 RNA 和 DNA，可 直接用于后续的反转录、Northern 杂交、测序等应用。

储存：室温可保存 2 年。
使用防护建议：Serum/Plasma miRNA Reagent 溶液中含有胍盐，其具有强烈的腐蚀性，试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等防护措施，如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗，再另行就医。
自备试剂：异丙醇、乙醇、75%异丙醇、2ml EP 管
操作方法：
(1) 向 1.5ml EP 管中加入 800μl Serum/Plasma miRNAReagent。将 300μl 血清或血浆样本加入到上述 800μlmiRNA Reagent A 中，用腕力混匀 30s,室温放置 5min。
(2) 13,000rpm 离心5min，将上清约 1ml 吸入到新的 2ml EP管中。加入 1ml 异丙醇，上下颠倒混合均匀。
(3) 将上述溶液分三次加至吸附柱中（每次约 700μl），13,000rpm 离心 15s，倒掉过柱液。
(4) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000rpm离心 15s，倒掉过滤液。
(5) 向吸附柱中加入 500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000rpm离心 15s，倒掉过滤液。
(6) 吸附柱 13,000rpm 空离心 2min，去掉残留的乙醇。
(7) 将吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室温放置 2min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入 30μl RnaseFree H2O，室温静置 2min，13,000rpm 离心 2min，洗脱产物即为提取的 miRNA。
常见问题汇总：
(1) 由于血清血浆中的 miRNA 含量极低，提取的 miRNA 浓度通常在 5 ng/μl 以下，因此难以用常规的 NanoDrop 测量浓度，建议直接使用 10 μl 进行下游反转录。由于本试剂盒提取的是小 RNA，该浓度下的 miRNA Copy 数足以进行下游检测。
(2) 由于血清血浆中 miRNA 的含量低，为了获得更可靠的实验数据，建议使用特异性和灵敏度更好的 TaqMan 探针法进行 miRNA 的下游检测。本试剂盒提取的 miRNA 并不限于其它检测方法和用途，包括 SYBR Green 法检测、二代测序、芯片等检测领域。
(3) 血清血浆 TaqMan miRNA 反转录试剂盒为血清血浆专用，不可用于细胞和组织的 miRNA 检测实验。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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