2XRAPA3G全能PCR Mix

商品属性：

RAPA3G DNA聚合酶为经电子重构架的第三代Taq DNA聚合酶，第三代DNA聚合酶具有高度的杂质耐受性、长片段扩增能力、高扩增成功率、高产量等特征，从而使得RAPA3G系列产品可用于粗制样品的直接扩增，无需核酸纯化步骤。杂质耐受性方面，该酶可耐受植物中的多糖多酚；全血、血清、血浆中的肝素、高浓度的血红蛋白、甘油三脂；乙醇；胍盐；SDS等强PCR抑制剂。在血液直扩PCR实验中，RAPA3G PCR Mix性能与KAPA3G DNA聚合酶展现出同等的表现，其性能表现优于二代聚合酶（血液扩增Hemo KlenTaq Mix）。在植物直扩PCR实验中，RAPA3G PCR Mix在配合DNA释放剂的条件下与KAPA3G Plant PCR试剂盒性能一致。长片段扩增能力方面，使用该酶可轻松扩增8kb的基因组片段，20kb的λ DNA，8kb的cDNA。该酶具有6kb/min以上的扩增速度，可显著的缩短PCR的扩增时间，在常规测试条件下，10s的延伸时间可完成1kb的基因组DNA扩增。在PCR扩增成功率方面，与其它类型的PCR扩增试剂对比中，RAPA3G PCR Mix表现出的PCR扩增成功率。此外，该酶包含一定比例的RAPA HiFi超保真DNA聚合酶，因此其具有一定的保真性能（经蓝白斑测试，其保真性能约为Taq DNA聚合酶的56倍）。另外，RAPA3G系列产品均采用专有的热启动技术，确保50°C以下无活性，仅有95°C加热5min以后才能恢复其活性，因此可最大限度的提高扩增的特异性，减少非特异性产物的产生。该PCR Mix具有5'-3'的聚合酶活性、5'-3'的外切酶活性和3'-5'的外切酶活性，产物部分带有"A"尾巴，部分为平末端，因此产物均可用于TA克隆或平端克隆。
特征和用途
快速扩增：具有6kb/min的扩增能力，1kb片段可在25min内完成扩增. 高成功率扩增：RAPA3G PCR Mix具有最高的PCR扩增成功率。 液体样品直接扩增：全血、血清、培养细胞、尿液等样本直接进行PCR扩增，无需核酸纯化。 组织样本直接扩增：叶片、种子、果实、动物组织等样品，可以直接扩增，也可采用DNA释放剂简单处理后直接扩增，无需核酸纯化。 长片段扩增：质粒、λ DNA 等简单模板可以有效扩增>20 kb，基因组可以有效扩增>8 kb，cDNA可以有效扩增>8kb。 高保真扩增：保真度是 Taq DNA Polymerase 的56 倍。 高特异性：采用专有热启动技术，50°C以下无活性，仅有95°C加热5min才能恢复酶活。
RAPA3G DNA聚合酶对抑制物耐受性
SDS 0.01% 胍盐 0.25% 乙醇 5% 全血 15% 肝素 0.1IU/ml 血清 15% Trizol 0.5% 血浆 2% 血红蛋白 30μM 尿液 5%
50μl体积建议添加的样品量
抗凝全血 2.5 μl 培养细胞 >100个 血清 2.5 μl 组织 0.1mg 尿液 2.5 μl 毛发囊 1-3个 血浆 1 μl gDNA 1-400ng 植物叶片 2mm cDNA 1-400ng 植物粗提物 2-4 μl 质粒 0.1-10ng
储存
长期储存置于-20°C以下，可保存2年，避免反复冻融；短期使用置于4°C（3个月）保存，一经融化后请放置于4°C，勿再冻存。
反应实例
1. 模板适应性强，长片段和短片段都可有效扩增
Lane 1：λDNA 500bp, 2：λDNA 1kb, 3：λDNA 2kb, 4：λDNA 5kb, 5：λDNA 8kb, 6：λDNA 15kb, 7：λDNA 20kb, 8：human 500bp ,9：human 1kb, 10：human 2kb ,11：human 5kb, 12：human 8kb, 13：cDNA 166bp, 14：cDNA 552bp, 15：cDNA 960bp, 16：cDNA 1574bp, 17：cDNA 1705bp, 18：cDNA 2755b,p 19：cDNA 4128bp, 20：cDNA 7600bp, M：DNA Marker 10000
选取三种DNA模板，使用RAPA3G PCR Mix进行扩增，循环数统一为28 cycles，结果如上图所示，对于不同种类DNA模板和不同长度的靶基因，RAPA3G PCR Mix均有良好的扩增性能。
2. 对于粗制样品DNA具有的耐受性
分别以人全血、血清、叶片粗制品DNA以及大豆种子粗制品DNA为模板，使用RAPA3G PCR Mix进行PCR扩增，结果如上图展示，各种粗制样品都有良好的扩增，其中全血和血清可耐受15%。
3.扩增灵敏度高，λDNA模板低至0.1pg也可以有效扩增
以λDNA为模板，选取不同模板使用量，采用RAPA3G PCR Mix进行扩增2kb靶基因，循环数统一为28 cycles，结果如上图所示，λDNA模板低至0.1pg也可以有效扩增

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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