RAPA3G动物组织直扩PCR试剂盒

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

RAPA3G DNA 聚合酶为经电子重构架的第三代 Taq DNA 聚合酶，第三代 DNA 聚合酶具有高度的杂质耐受性、 长片段扩增能力、高扩增成功率、高产量，这些特点使得 RAPA3G 系列产品可用于粗制样品的直接扩增，无需核酸纯 化步骤。该 PCR Mix 具有 5’-3’的聚合酶活性、5’-3’的外切 酶活性、3’-5’的外切酶活性，产物部分带有"A“尾巴，部 分为平末端，因此产物可用于 TA 克隆或平端克隆。

特点和用途：
（1）高杂质耐受性：该 PCR Mix 可直接使用血液、蛋白含量较高的动物组织材料进行 PCR 扩增，无需基因组提取。
（2）高效的快速 DNA 释放剂：尽管该 PCR Mix 可以直接使用组织细胞材料进行扩增，但我们仍然推荐采用 DNA 释放剂进行样本的快速前处理（约需要 5min，可高通量操作）。DNA 释放剂的前处理，使得制备的 DNA 模板可以进行多次、多基因扩增，并长期保存 DNA，经 DNA 释放剂处理的样本，在室温条件下放置 1 个月，无任何后续影响，-20 可长期保存。
（3）快速 PCR：该酶具有 6kb/min 以上的扩增速度，可显著的缩短 PCR 的扩增时间，在常规测试条件下，10s 的延伸时间可完成 1kb 的基因组 DNA 扩增。
（4）粗制样品的扩增能力：扩增能力>4kb。
（5）高保真性能：该制品包含一定比例的 RAPA HiFi 超保真 DNA 聚合酶，因此其具有一定的保真性能（经蓝白斑测试，其保真性能约为 Taq DNA 聚合酶的 56 倍）。
（6）热启动，防止非特异性扩增：RAPA3G 系列产品均采用  专有的热启动技术，确保 50 度以下无活性，仅有 95 度加热 5min 以后才能恢复其活性，因此可最大限度的提高扩增的特异性，减少非特异性产物的产生。
包装：
2×RAPA3G PCR Mix (with Dye) 1ml×2
快速 DNA 释放剂 A 20 ml
快速 DNA 释放剂 B 20 ml
储存：长期储存置于-20°C 以下，可保存 2 年；短期使用置于 4°C（3 个月）保存。
使用方法
1. DNA 释放
（1）采用加热法：取 2-10 个毛发囊、1-10mg 动物组织等材料，放入到 0.2ml EP 管中，加入 50 μl 快速 DNA 释放剂A，于 PCR 仪中 98°C 加热 5min，加热完毕后加入 50 μl快速 DNA 释放剂 B，混合均匀，即可使用。
（2）采用钢珠研磨法：取 1-10mg 动物组织等材料，放入到 2ml EP 管中，加入 250 μl 快速 DNA 释放剂 A 和 2-3 粒钢珠，研磨 1-2min 成浆体装。研磨完毕后加入 250 μl 快速DNA 释放剂 B，混合均匀，即可使用。
2. 按下表配制 PCR 反应体系并混合均匀：
2×RAPA3G PCR Mix (with Dye) 25 μl
上游引物(10 μM) 2 μl
下游引物(10 μM) 2 μl
步骤 1 制备的模板 DNA 2 μl
ddH2O 19 μl
注意：当扩增片段>5kb 时，引物用量调整为 0.25-0.5μl。
3. PCR 扩增循环参数
循环数 温度 时间
预变性 95°C 5min
25-40 Cycles
95°C 20s
50~60°C 20s
72°C 4-6kb/min
末延伸 72°C 2min
请注意：（1）该制品为热启动制品预变性步骤 5min 不可缩短，否则 DNA 聚合酶无法恢复活性。（2）当扩增片段<1kb时，延伸时间使用 1-2kb="" 2-3kb="">3kb 时，请按照 2kb/min 的延伸时间进行设置。(3)尽管该酶具有 6kb/min 的延伸速度，但按照 2kb/min 设置延伸时间的条件下，能获得最高的产量。
3. 注意事项：(1) 当模板 GC 含量>70%时，请添加5× Q-Solution。(2)当采用全血、血浆等蛋白含量的样本时，扩增完毕后可能会有变性的蛋白沉淀，请离心后再进行点样和电泳。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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