HiFi One-Step RT-PCR Mix(电泳)

商品属性：

末端转移酶（TdT）是一种不依赖于模板的 DNA 聚 合酶，催化脱氧核苷酸结合到 DNA 分子的 3’羟基端。带有 突出、凹陷或平滑末端的单双链 DNA 分子均可作为 TdT 的 底物，加尾长度可达 5~300nt。本酶经电子重构架技术筛选， 使其可以在 45°C 高温下反应，从而避免因 DNA 二级结构造 成的加尾效率下降。 该酶广泛用于 DNA 的 3’末端添加同聚物、利用修饰碱 基（如 ddNTP，DIGdUTP）标记 DNA 3’末端、TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记技术（细胞凋亡的原位检测）等试验。

活性定义：37 ℃ 60 分钟内，催化 1nmol dNTP 加入到多聚核苷酸 3’羟基末端中所需的酶量定义为 1 个活性单位
热失活：75°C 20min。
储存：-20℃ 可保存 3 年。
注意事项
1、适量 EDTA 可使 Terminal Transferase 的活性丧失。
2、金属离子螯合剂，较高浓度的铵根离子、氯离子、碘例子和磷酸根离子均对 Terminal Transferase 活性具有抑制作用。
3、DNA 末端 mol 数的计算，长度为 100bp 的 DNA：1pmol末端 DNA=0.33ng。

本试剂采用稳定高效的 RT-PCR 预混体系，是以 RNA 为模板进行一步法 RT-PCR 的专用试剂。其原理为用基因特 异性引物进行反转录反应，获得第一链 cDNA（不可使用 Oligo（dT）或 Random Rimer 合成第一链 cDNA），再使 用基因特异性正向引物和反向引物进行 PCR 扩增，在同一 反应体系中一步完成从反转录到 PCR 的全部过程。反应体 系中已含有电泳所需的指试剂（蓝色和黄色），反应后可以 直接进行电泳。 在本试剂盒中，将耐热 M-MLV 反转录酶、Rnase Inhibitor、 Hotstart 高 保 真 DNA 聚合酶以及稳定剂等配制成 50×One-Step Enzyme Mix 预混液；反应 Buffer、dNTP 以及 电泳指示染料配制成 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer，因此 使得操作更加简单便，扩增产物可用于平端克隆和 DNA 测 序。
主要优势：
 耐热M-MLV反转录酶可在55℃反应能更好的打开复杂二级结构，只需 10min 即可完成逆转录。
 DNA 聚合酶为热启动型高保真酶，能够有效的抑制非特异性反应且具有较高的校正活性，酶激活仅需 2min。
 具有宽泛的模板量兼容性，10 ng~1μg 都可有效扩增。
 反应过程中无需开盖，避免了操作过程中的污染危害。
组分
名称 250T
50×One-Step Enzyme Mix 100 μl
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 1 ml
RNase Free H2O 1 ml×3
储存：请置于-20°C，可保存 2 年；避免反复冻融。
注意：
1.50×One-Step Enzyme Mix 粘度高，第一次使用之前要离心收集至反应管底部，吸取时应缓慢小心。
2.由于使用了 Hotstart 高保真 DNA 聚合酶，反应配制可在常温进行，但各组分应-20°C 保存。
实验操作和反应条件：
1. 按以下组分配制反应液
RNA（病毒 DNA/RNA 样品直接使用 2~10μl） 10 ng~1 μg
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 4 μl
50×HiFi One-Step RT-PCR Enzyme Mix 0.4 μl
基因特异性上游引物（10μM） 0.8 μl
基因特异性下游引物（10μM） 0.8 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
注意：超过 1 μg 的 RNA 模板量会抑制 PCR 反应，建议第一次可使用 200 ng 的 RNA 模板，然后根据结果进行优化。
2. 在 PCR 仪上按以下条件进行 RT-PCR 反应:
55°C， 10min 逆转录反应
95°C， 2min 失活 M-MLV，并激活高保真聚合酶
95°C， 20s 30~40 cycles
TM°C， 20s
72°C ，
2Kb/min
72°C， 2min 末端延伸
3. PCR 反应结束后，可取 5 μl 产物直接进行电泳检测。预混液中已经包含绿色染料，无需再加入 DNA Loading Buffer。1% Agarose 电泳时，蓝色指示剂指示 3~5 kb，黄色指示剂指示<50 bp。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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