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Endonuclease IV

简要描述:

Endonuclease IV公司正在出售的产品:EBV-转化人淋巴细胞(彝族) 烟碱型乙酰受体α7封闭多肽 指环虫属通用PCR检测试剂盒 大鼠褪黑(MT/MLT) ELISA Kit 土壤淀粉活性比色法检测试剂盒 松乳菇 原钙粘蛋白15抗体

更新时间:2024-01-14

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Endonuclease IV

商品属性:

产品名称

规格

货号

Endonuclease IV

1000U

A-PJ1127

Endonuclease IV

5000U

A-PJ1127

QQ截图20240110094643.jpg

来源于 E.coli,参与 DNA 损伤修复。该酶可识别双链 DNA 分子上的脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点,并切割 AP 位点 5′ 端的第一个磷酸二酯键,产生 3′羟基和 5′ 脱氧核糖磷酸末端(deoxyribose phosphate,dRP)。另外该酶还具有 3′二酯酶活性,能从 DNA 的 3′末端释放磷酸甘油醛、完整的脱氧核糖 5′-磷酸和磷酸。该酶的最佳底物为 AP 双链 DNA,但对 AP 单链 DNA 也有一定活性。

储存:置于-20°C 可保存 2 年,避免反复冻融。
活性定义:一单位指在 10μl 反应体系中,37°C 反应15min,切割 1 pmol 含一个 AP 位点的 34mer 寡核苷酸双链,所需要的酶量。
1×Endo IV Buffer:20mM Tris-HCl,pH8.5; 50mM KCl;0.1% Tween20;0.02% BSA, 5mM Mg2+。
热失活:85°C,20min。
酶储存液:50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol, pH 7.5。
使用方法
含 AP 位点的 DNA 2-20pmol
10X Endon IV Buffer 2 μl
Endonuclease IV (20 U/μl) 1 μl
ddH2O Up to 20 μl
37°C 反应 15-30min。

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PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

公司正在出售的产品:

人免疫缺陷病毒1MF型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

β2糖蛋白1抗体IgMELISA试剂盒 β2-GP1 Ab IgM免费代测试剂

人腺病毒D90型探针法荧光定量PCR试剂盒

鸭肝炎病毒1PCR检测试剂盒说明书

蛋白激活受体1ELISA试剂盒 PAR1免费代测试剂

支原体通用PCR检测试剂盒直销

鹿源性成分(Deer)核检测试剂盒

细胞附着蛋白1ELISA试剂盒

马炎病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

流行性肋腺炎病毒PCR检测试剂盒

低氧诱导因子3αELISA试剂盒

马病毒性动脉炎病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

牦牛源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒

多巴色异构ELISA试剂盒

产肠毒性大肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

疱疹病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

多药耐药关联蛋白1ELISA试剂盒

弧菌O139(VC O139)核检测试剂盒

疱疹病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

二肽基肽7ELISA试剂盒

禽腱鞘炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

毛癣菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒

泛结合E2CELISA试剂盒

蜡样杆菌PCR检测试剂盒(荧光PCR法)

猫支原体PCR检测试剂盒

防御β121ELISA试剂盒

佩氏着色霉PCR检测试剂盒供应

诺卡菌探针法荧光定量PCR试剂盒

分离蛋白1ELISA试剂盒

麻风分枝杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

漏斗状带绦虫PCR检测试剂盒供应

人催乳(PRL)试剂盒ELISA

禽类肉瘤病毒PCR检测试剂盒直销

拟无枝菌菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒

(NO)elisa试剂盒

流感嗜血杆菌B型染料法荧光定量PCR试剂盒

附红细胞体(嗜血支原体)属通用探针法荧光定量PCR试剂盒

人白介29(IL-29)ELISA检测试剂盒

轮状病毒群PCR检测试剂盒

溃疡分枝杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

γ干扰诱导蛋白16/p16(IFI16/p16)ELISA Kit

Endonuclease IV附红细胞体属通用探针法荧光定量PCR试剂盒

鱼源性成分(Fish)核检测试剂盒

人单纯疱疹病毒Ⅰ+Ⅱ(HSVⅠ+Ⅱ)抗体(IgM)试剂盒ELISA

病毒N9亚型(AIV-N9)核检测试剂盒