Super ECL Substrate

商品属性：

超敏 ECL 显色液用于 Western、Northern 和 Southernblot 分子杂交的化学发光检测，比传统化学显色法灵敏度高，可达 pg 水平。原理是采用新型发光底物（Luminol），其与辣根过氧化物酶反应时产生很强的发光信号，在暗室中对X-光片感光，以此检测微量蛋白而获得理想的实验结果。海基增强型 ECL 显色液具有灵敏度高，持续时间长等特点。

应用
在 Western 印迹分析，核酸杂交以及 EMSA 实验中，HRP标记的二抗或探针与靶分子结合再与底物反应产生可见光。
储存：2-8°C，Super ECL A 要求避光保存。
操作方法（以 Western Blot 为例)
1．按每平方厘米膜面积用 0.1-0.2 ml 配置显色液：根据显色液的需要量，取等体积 A 液和 B 液，混匀后避光保存备用；该显色液必须现配现用。
2．2. 取出膜，平放在干净的保鲜膜上，膜的正面（蛋白质面）朝上，在膜的中央加适量的配置好的显色液（6×8 cm 的膜加 2 ml 显色液），溶液向四周迅速扩散，覆盖所有膜面。室温保温 5 分钟左右，在此过程中请仔细观察信号的出现。注意：如果信号强，在暗室中能很快看到阳性信号出现。
3．3. 待信号出现且稳定后，用镊子夹起膜，除去多余的显色液，平放在干净的保鲜膜上，膜的正面（蛋白质面）朝上，在转移膜的上面再覆盖一层保鲜膜，除去保鲜膜与转移膜之间的空气泡，请务必保证保鲜膜是干净的，不被其他杂物或液体污染。
4．4. 在暗室中，将膜的正面对着 X-光片，放入暗盒。第一次曝光时间在 1 分钟左右(有经验的操作者可以根据信号的强弱自行决定)，立即按要求对 X-光片进行显影和定影，确定最佳曝光时间。曝光时间从数秒到数小时不等；特别弱的过夜曝光也可。
注意
1.PVDF 膜较硝酸纤维膜能更好的结合蛋白，因此呈现较强的信号。选高质量的 PVDF 膜；尽可能不用 Nylon 膜。
2.2.与抗体结合以后，要保证膜处于湿润状态，否则会导致背景较高。
3.3.没有信号的原因：有些抗体不识别变性抗原，有时需要考虑电泳过程对蛋白质结构的影响；样品中无待测蛋白质或含量过低；一抗效价低，用量少，可适当增加一抗的用量；
4.4.背景过高原因：转移膜封闭不充分；与抗体孵育后洗涤；膜在处理过程中过干；二抗用量过多等。
5.5.注意及时更换显影液、定影液。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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