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加A聚合酶(E.coli)

简要描述:

加A聚合酶(E.coli)公司正在出售的产品:鼠肝星形细胞 电导钙激活钾通道蛋白1封闭多肽 犬疱疹病毒PCR检测试剂盒 大鼠热休克蛋白60(Hsp-60)ELISA检测试剂盒 磷脂C(PLC)活性比色法检测试剂盒 鼠尾菌 11号染色体开放阅读框65抗体

更新时间:2024-01-12

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加A聚合酶(E.coli)

商品属性:

产品名称

规格

货号

A聚合酶(E.coli

100U

A-PJ1060

A聚合酶(E.coli

1000U

A-PJ1060

本 E. coli Poly(A) Polymerase 为高效加 A 聚合酶,该酶以RNA为模板在RNA的3′末端加入20~200个A碱基。可应用于增强 mRNA 的稳定性,及 microRNA 加 A 尾,为cDNA 合成提供 oligo-dT 引物结合位点等。该酶以单链 RNA作为引物,ATP 作为底物进行聚合反应。
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活性定义:
在 37℃、pH7.9 的条件下,以 ATP 为底物,10 分钟内把1 nmol 的 AMP 聚合到 RNA 上所需要的酶量定义为 1 个活性单位(U)。
应用:
RNA 3' 标记
 microRNA 加 A 尾,为 cDNA 合成提供 oligo-dT 引物结合位点
 增强 RNA 稳定性
储存:-20°C 可保存 2 年。
热失活条件:65°C 20 min
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2. 混合均匀后,37°C 反应 1 小时。即可用于后续实验。注:不同的实验需要加 A 的量会有所不同,可通过减少反应时间来调整加 A 的长度,该酶在 37°C 反应 30 分钟时可加30 个 A 碱基,1 小时可加 100 个 A 碱基。

QQ截图20240110094643.jpg


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PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

公司正在出售的产品:

小孢子酒曲菌染料法荧光定量PCR试剂盒

胞浆型磷脂A2-αELISA试剂盒 cPLA2-α免费代测试剂

丁型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

病毒PCR检测试剂盒说明书

单纯疱疹病毒抗原2ELISA试剂盒 HSV-Ag2免费代测试剂

鼠痘病毒PCR检测试剂盒供应

猫瘟病毒(FPV)核检测试剂盒

细胞周期HELISA试剂盒

马苏哈鱼病毒PCR检测试剂盒

呼吸道病毒多重PCR检测试剂盒

弹性蛋白3AELISA试剂盒

马腺病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

马钱子探针法PCR鉴定试剂盒

低氧上调节因子1ELISA试剂盒

败血梭状芽胞杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

侵入性丝囊霉菌(溃疡综合症病原)探针法荧光定量PCR试剂盒

丁型肝炎病毒ELISA试剂盒

绵羊痘病毒(SPPV)核检测试剂盒

禽阿尔法疱疹病毒型=马立克病病毒PCR检测试剂盒

多巴胺羟化ELISA试剂盒

前胡探针法PCR鉴定试剂盒

马疱疹病毒4PCR检测试剂盒

多肽YYELISA试剂盒

链球菌属通用探针法荧光定量PCR试剂盒

马轮状病毒PCR检测试剂盒

二氢嘧啶脱氢[NADP+]ELISA试剂盒

牛细小病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

腔阔盘吸虫PCR检测试剂盒

防御β110ELISA试剂盒

马皮疽组织胞浆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

连翅染料法PCR鉴定试剂盒

人毒蕈碱型乙酰受体M2(mAChRM2)自身抗体试剂盒ELISA

七星库道虫探针法荧光定量PCR试剂盒

牛支原体PCR检测试剂盒

Na+/H+交换体3(NHE3)elisa试剂盒

盖塔病毒探针法荧光定量RT-PCR探针法荧光定量PCR试剂盒

产气肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

人超敏热休克蛋白60(HSP-60)ELISA检测试剂盒

伪狂犬病病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

绵羊莫拉菌探针法荧光定量PCR试剂盒

α烯醇化(αENOL) ELISA试剂盒

A聚合酶(E.coli鸡皮刺螨探针法荧光定量PCR试剂盒

中华鳖虹彩病毒(STIV)核检测试剂盒

人成熟促进因子(MPF) ELISA试剂盒

枪状肝吸虫PCR检测试剂盒