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Equi-phi29 DNA Polymerase

简要描述:

Equi-phi29 DNA Polymerase公司正在出售的产品:人脑髓母细胞瘤细胞 线粒体脱偶连蛋白2封闭多肽 卡奇谷病毒PCR检测试剂盒 大鼠去甲(NA)ELISA试剂盒 磷丙糖异构(TPI)活性比色法检测试剂盒 济州岛古名菌 2号染色体开放阅读框68抗体

更新时间:2024-01-12

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Equi-phi29 DNA Polymerase

商品属性:

产品名称

规格

货号

Equi-phi29 DNA Polymerase

1000U

A-PJ1053

Equi-phi29 DNA Polymerase

10KU

A-PJ1053

是 phi29 的改造体,并经多次纯化分离而得。在保留了 phi29 DNA 聚合酶的链置换、连续合成特性(>70kb)的基础上,提高了滚环扩增的反应温度,该酶酶可以在 42 度条件下持续的进行 DNA 合成(而 phi29 DNA 聚合酶在此温度下反应活性很低)。

这种高温的反应特性,在以下几个方面对实验有明显的提升:

(1)在 NGS 测序中,其提升了高 GC 含量、回文结构等复杂模板的延伸能力,使得 NGS 的覆盖度更均一,降低测序所需深度;

(2)高温的反应条件,提升了基因组 DNA的 WGA 产物的合成量,并可以进行变温扩增;

(3)降低测序中 Gap 区域,提升单细胞测序的数据质量和完整度;

(4)降低非特异性扩增产物;

(5)提升 MDA/RCA 等实验的扩增性能和特异性。
除此外,该酶仍然具有很强的 3’→5’外切酶校读功能,合成的 DNA 片段保真性高。该酶的外切酶活性较强,因此合成过程中引物需要 3’端硫代修饰,以降低外切活性对引物的切割效应。
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储存:-20℃可保存 3 年。
image.png注意:QQ截图20240110094643.jpg不同的实验类型中,Oligo根据实验需要自行选择。
2. 引物和模板退火:体系配制完毕后,放置到 PCR 仪中,95℃ 3min,25℃ 3min。3. 退火完毕后,向退火产物中加入 1μl Equi-phi29 DNAPolymerase,混合均匀。
4. 扩增反应
4.1 恒温扩增
对于环状DNA模板采用恒温反应作为推荐使用30℃恒温扩增,30℃孵育 6~16h.该酶在 30-42℃条件下均可工作,
必要时根据实验类型进行调整。
4.2 变温扩增
对于基因组 DNA 或 cDNA 模板,推荐使用变温扩增反应,以在短时间内获得更高产量,并提高了低浓度模板的扩增产量。在 PCR 仪上做如下设置:
【30℃ 5min;42℃ 15s】循环 72 次(约 6h)或 120次(约 10h).必要时,反应结束后,可于 65°C 10min 进行失活反应。
使用注意事项
(1)必要时可单独额外添加终浓度 1 mM DTT 和 0.2mg/ml BSA,可提高反应效率。
(2)该酶的最佳反应温度为 42 ℃ (在 30~42℃之间均有活性)。
(3)65℃ 10min 即可使该酶失活。
(4)根据实验类型需要,调整dNTP的浓度100~500 μM。
(5)添加 Yeast Pyrophosphatase可提高 DNA 产量。
(6)反应引物 3’端的硫代修饰可避免引物降解。



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PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

公司正在出售的产品:

禽白血病病毒G亚群染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

臂板蛋白3AELISA试剂盒 Sema 3A免费代测试剂

水牛泰勒虫染料法荧光定量PCR试剂盒

败血梭状芽胞杆菌PCR检测试剂盒直销

带粘蛋白ELISA试剂盒 ZAN免费代测试剂

猿分支杆菌PCR检测试剂盒直销

口蹄疫病毒O(FMDV-O)核检测试剂盒

周期依赖性激6ELISA试剂盒

马胃葡萄球菌PCR检测试剂盒

古典猪瘟病毒PCR检测试剂盒科研用

磷转移1ELISA试剂盒

玛尔摩分枝杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

马虻染料法荧光定量PCR试剂盒

登革热ELISA试剂盒

漏斗状带绦虫探针法荧光定量PCR试剂盒

禽白血病病毒B亚群染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

凋亡蛋白活化因子1ELISA试剂盒

猪水疱病毒(SVDV)核检测试剂盒

禽波氏杆菌PCR检测试剂盒

短腭肺鼻腔上皮癌关联蛋白2ELISA试剂盒

气肿疽梭状杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒

马虻探针法荧光定量PCR试剂盒

多肽-N-乙酰氨基半乳糖转移2ELISA试剂盒

裂谷热病毒PCR检测试剂盒供应

马链球菌马亚种PCR检测试剂盒

二羟基赖正己氨ELISA试剂盒

牛丘疹性口炎病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

侵袭性大肠杆菌PCR检测试剂盒

芳犬尿氨甲酰胺ELISA试剂盒

马泰勒梨形虫()探针法荧光定量PCR试剂盒

立克次体PCR检测试剂盒(荧光PCR法)

人多聚腺苷二磷核糖聚合(PARP)检测试剂盒elisa

普罗威登斯菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒

疟原虫通用探针法荧光定量PCR试剂盒

人蛋白Z(ProteinZ)试剂盒ELISA

马虻探针法荧光定量PCR试剂盒

肠道致细胞病变人孤儿病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

人成纤维细胞生长因子6(FGF6)ELISA试剂盒

荧光假单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒

猴痘病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

α肌动蛋白(α Actin)ELISA检测试剂盒

Equi-phi29 DNA Polymerase质型多角体病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

兔出血症病毒通用型(RHDV)核检测试剂盒

人超敏前列腺特异性抗原(PSA-U S)ELISA试剂盒

气肿疽梭状杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒