Equi-phi29 DNA Polymerase

商品属性：

是 phi29 的改造体，并经多次纯化分离而得。在保留了 phi29 DNA 聚合酶的链置换、连续合成特性（>70kb）的基础上，提高了滚环扩增的反应温度，该酶酶可以在 42 度条件下持续的进行 DNA 合成（而 phi29 DNA 聚合酶在此温度下反应活性很低）。

这种高温的反应特性，在以下几个方面对实验有明显的提升：

（1）在 NGS 测序中，其提升了高 GC 含量、回文结构等复杂模板的延伸能力，使得 NGS 的覆盖度更均一，降低测序所需深度；

（2）高温的反应条件，提升了基因组 DNA的 WGA 产物的合成量，并可以进行变温扩增；

（3）降低测序中 Gap 区域，提升单细胞测序的数据质量和完整度；

（4）降低非特异性扩增产物；

（5）提升 MDA/RCA 等实验的扩增性能和特异性。
除此外，该酶仍然具有很强的 3’→5’外切酶校读功能，合成的 DNA 片段保真性高。该酶的外切酶活性较强，因此合成过程中引物需要 3’端硫代修饰，以降低外切活性对引物的切割效应。

储存：-20℃可保存 3 年。
注意：在不同的实验类型中，Oligo根据实验需要自行选择。
2. 引物和模板退火：体系配制完毕后，放置到 PCR 仪中，95℃ 3min，25℃ 3min。3. 退火完毕后，向退火产物中加入 1μl Equi-phi29 DNAPolymerase，混合均匀。
4. 扩增反应
4.1 恒温扩增
对于环状DNA模板采用恒温反应作为推荐使用30℃恒温扩增，30℃孵育 6~16h.该酶在 30-42℃条件下均可工作，
必要时根据实验类型进行调整。
4.2 变温扩增
对于基因组 DNA 或 cDNA 模板，推荐使用变温扩增反应，以在短时间内获得更高产量，并提高了低浓度模板的扩增产量。在 PCR 仪上做如下设置：
【30℃ 5min；42℃ 15s】循环 72 次（约 6h）或 120次（约 10h）.必要时，反应结束后，可于 65°C 10min 进行失活反应。
使用注意事项
（1）必要时可单独额外添加终浓度 1 mM DTT 和 0.2mg/ml BSA，可提高反应效率。
（2）该酶的最佳反应温度为 42 ℃ （在 30~42℃之间均有活性）。
（3）65℃ 10min 即可使该酶失活。
（4）根据实验类型需要，调整dNTP的浓度100~500 μM。
（5）添加 Yeast Pyrophosphatase可提高 DNA 产量。
（6）反应引物 3’端的硫代修饰可避免引物降解。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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