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Klenow Fragment(exo-)

简要描述:

Klenow Fragment(exo-)公司正在出售的产品:人结肠癌细胞 泛蛋白连接D2封闭多肽 肉芽肿鞘杆菌PCR检测试剂盒 大鼠全段甲状旁腺(i-PTH)ELISA检测试剂盒 磷果糖激(PFK)/6磷果糖激/果糖6磷激活性比色法检测试剂盒 粉红色杆状菌 2号染色体开放阅读框25抗体

更新时间:2024-01-12

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Klenow Fragment(exo-)

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断!

货号

产品名称

规格

A-PJ1054

Klenow Fragment(exo-)

1000U

Klenow 片段(3′→5′ exo-)是 DNA 聚合酶 I 的 N末端截短物,它保留了 DNA 聚合酶活性,但失去了 5′→3′核酸外切酶活性。该酶进一步经突变(D355A,E357A)去除了其 3′→5′的核酸外切酶活性。因此该 DNA 聚合酶无任何外切酶活性,仅包含了 DNA 聚合酶活性,广泛用于标记探针制备、cDNA 第二条链的合成等建库试验。
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单位定义
一个活力单位即在 37°C 条件下,30 分钟内催化 10 nmoldNTP 的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。该酶保存液中含有 50%甘油。
10×Klenow Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0 at 25 °C), 50mM MgCl2, 10 mM DTT. 该酶兼容 PCR Buffer 和内切酶Buffer。
应用:
(1)用随机引物制备探针
(2)随机引物法标记
(3)cDNA 第二条链的合成
(4)该酶不能用于产物平端不齐
失活:
75°C,20min 失活。
储存:-20℃可保存 3 年。
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95°C 5min 冰上放置 5min。
2. 聚合反应
加入 0.5 μl Klenow Fragment(exo-),混合均匀。37°C 反应 15min,75°C 20min 失活。

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PCR 反应需要使用哪些试剂和设备?

试剂:
模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物;
设备:
PCR仪:用于控制反应温度,保证PCR反应时不同温度环节的严格控制;电泳槽:用于分离PCR扩增产物;核酸提取仪:从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是,只有在有序齐全的基础上,才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验:

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:

一、变性:

利用高温(93-98℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性:

在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸:

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化:

1、变性温度和时间:

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s,再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,小于1kb, 1min足够;大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意,延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%,因此不管模板浓度是多少,20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多,非特异扩增增加。

公司正在出售的产品:

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吡哆醛/吡哆醇维生B6ELISA试剂盒 PDXP免费代测试剂

小泰勒虫染料法荧光定量PCR试剂盒

索氏梭状杆菌PCR检测试剂盒说明书

戴帽蛋白肌ZβELISA试剂盒 CAPZβ免费代测试剂

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马特定基因序列PCR检测试剂盒

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脑膜炎败血金黄杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

禽白血病病毒A亚群染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

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