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更新时间:2024-01-12
商品属性:
产品名称 | 规格 | 货号 |
5min极速病毒RNA提取试剂盒 | 50T | A-PJ1071 |
本试剂盒采用裂解液,可快速可靠的从病毒液样本中纯化出高纯度的总 RNA。该试剂盒是目前国际上操作步骤最少、用时最短的病毒 RNA 提取试剂盒(仅需要 5 分钟)。应用本试剂盒提取的 RNA 可直接用于反转录、基因克隆、定量 PCR 检测等多种分子生物学实验。
注意事项:
(1) 本试剂盒中的 Washing Buffer 中已经加乙醇,无需单独添加。
(2) RNA LB1 和 RNA BB2 均具有腐蚀性,注意防护。
操作方法
(1)裂解/上柱(1.5ml EP 管中处理)
液体样本:血清、血浆、唾液、痰液、尿液、细胞培养病毒上清液等液体样本直接吸取 150 μl 到 1.5ml EP 管中,并加入 120 μl RNALB1,漩涡混合均匀 10 秒。打开 1.5ml EP 管盖,并加入 500 μl RNABB2 中,漩涡混合均匀 10 秒。倒入吸附柱中,13000 rpm 离心 30秒,倒掉过柱后的废液,进行后续洗涤/洗脱步骤。
抗凝全血:直接吸取 150 μl 到 1.5 ml EP 管中,并加入 120 μl RNA
LB1,漩涡混合均匀 10 秒。打开 1.5 ml EP 管盖,并加入 500 μl RNA
BB2 中,漩涡混合均匀 10 秒。13000 rpm 离心 30 秒后,将上清液倒入吸附柱中,13000 rpm 离心 30 秒,倒掉过柱后的废液,进行后续洗涤/洗脱步骤。
固体样本:组织、粪便等样本。取 10~100 mg 固体材料样本,加入到 300 μl RNA LB1 中(1.5ml EP 管),并加入几粒钢珠(一般3~4 粒),置于组织研磨仪中,研磨 1 分钟。研磨完毕后,打开管
盖,向匀浆液中加入 750 μl RNA BB2,并 13000 rpm 离心 1 分钟。
打开管盖,用 1 ml 吸头吸取 750 μl 上清液到吸附柱中。13000 rpm离心 30 秒,倒掉过柱废液,进行后续洗涤/洗脱步骤。
(2) 洗涤和洗脱
上述裂解/上柱操作完毕后,向吸附柱中加入 500 μl WashingBuffer,13000 rpm 离心 15 秒,并倒掉过柱废液。重复此洗涤步骤一次。 将吸附柱重新放回离心机,13000 rpm 空离心 1min,将残留的乙醇甩干。 将吸附柱芯放入到 1.5 mL Nuclease Free收集管中,向吸附柱芯中加入 20~50 μl Nuclease Free H2O,室温放置1 min,13,000rpm离心 1min,洗脱液即为提取的病毒RNA,冷冻保存。
特别说明:
(1)RNA LB1 和 RNA BB2 含有高盐,在样本加入到此溶液后,病毒会迅速灭活。同时此溶液对皮肤有腐蚀性,务必做好防护,如接触到皮肤,用大量清水冲洗。
(2)样本处理过程中的吸头等材料可能含病毒分子,实验完毕后务必妥善处理,不能随意丢弃。
PCR基本步骤及注意事项?
一、实验原理
PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
二、主要的成分
1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。
注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。
2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。
PCR实验中应该注意的问题有哪些?
没有ct值
检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:
1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);
2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;
4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;
5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
ct值过晚
在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;
2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);
3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
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