Virus DNA/RNA cDNA Synthesis Kit

商品属性：

描述：本试剂盒采用稳定高效的反转录预混体系 5×Golden RT MasterMix 进行 RNA 的反转录反应，使用时只需加入模 板、引物和 RNase Free H2O 即可，大大简化了操作过程、 提高了效率、减少了操作过程中的人为误差。具有快速简便、 重复性高、特异性好、灵敏度高和稳定性好的特点。专用于 病毒 DNA/RNA 样品的反转录反应。 该预混体系包含点突变致 RNase H 活性缺失的 Golden MLV Reverse Transcriptase 反转录酶、dNTP、反应 Buffer 和 RNase Inhibitor。该试剂盒采用的反转录酶去除了 RNase H 活性，从而避免反转录过程中降解 RNA。同时经过突变文 库筛选，使得其热稳定性更强，可耐受 55℃高温反应。相比 于低温条件下反转录反应，采用高温反转录可显著打开 RNA 二级结构，从而提高复杂 RNA 模板的扩增性能、提高反转 录 cDNA 的长度和产量，从而提高后续检测的灵敏度。合成 的第一链 cDNA 可广泛用于 2nd Strand 的合成、杂交、PCR 扩增、Real-Time PCR 反应等。

组分

储存：请置于-20°C，可保存 3 年；避免反复冻融。
注：如 5×Golden RT MasterMix 出现沉淀属正常现象，可用手捂化，混合均匀后使用不影响实验结果。一步法 cDOn
1. 按以下组分配制反转录反应液
病毒 DNA/RNA 样品 2~10μl
5×Golden RT MasterMix 4μl
*20×Random Primer 1μl
Rnase Free H2O Up to 20μl
*注：反转录引物可根据需要改用特异性引物。
2.根据实际情况反转录可选择快速程序或标准程序
快速程序
 37°C 15~30min（cDNA 合成）
 85°C 5min（失活 MLV）
标准程序
 25°C 10min（引物配对）
 55°C 30~60min（cDNA 合成）
 85°C 5min（失活 MLV）
注：通常在定量 PCR 实验中使用快速程序进行反转录（反转录效率>80%），在进行高 GC 含量、含复杂二级结构、长片段的模板转录时采用标准程序（反转录效率>100%）。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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