5min极速RNA提取试剂盒

本试剂盒采用的裂解液，可快速可靠的从细胞、动物组织、植物组织、病毒液样本、抗凝全血、培养细菌中纯化出高纯度的总 RNA。该试剂盒是目前国际上操作步骤最少、用时最短的 RNA 提取试剂盒（最快 5 分钟）。应用本试剂盒提取的 RNA 可直接用于反转录、基因克隆、定量检测、文库构建、杂交等多种分子生物学实验。
商品属性：

注意事项：
(1) 本试剂盒中的 Washing Buffer 中已经加乙醇，无需单独添加。
(2) RNA LB1 和 RNA BB2 均具有腐蚀性，注意防护。操作方法
（1）裂解/上柱（1.5ml EP 管中处理）培养细胞：消化完毕后，离心收集细胞沉淀，用 20~30μl 水或PBS 重悬细胞沉淀（务必重悬充分）。加入 120μl RNA LB1 漩涡混匀 30s(有未溶解的细胞团块，用枪头吹打，助溶解)，加入 500μlRNA BB2 上下颠倒混合均匀，倒入吸附柱中。13000rpm 离心 30s，倒掉废液，进行后续洗涤/洗脱步骤。
组织样品----采用研钵进行研磨：用液氮研磨粉碎组织样本，将研磨粉碎的样品加入到 200μl RNA LB1 中，漩涡混合均匀 1min（有块状组织未溶解的，要使用枪头吹打，助消化），加入 500μl RNABB2 上下颠倒混合均匀，13000rpm 离心 15s。将上清倒入吸附柱中（动作需轻柔，勿将未消化的组织块倒入吸附柱），13000rpm 离心 30s，倒掉废液，进行后续洗涤/洗脱步骤。
组织样品----采用钢珠进行研磨：将组织样品加入到 300μl RNALB1 中（1.5ml EP 管），并加入几粒钢珠，置于组织研磨仪中，研磨 1~2min。向研磨后的匀浆液中加入 750μl RNA BB2，漩涡混匀5s，13000rpm 离心 1min。用 1ml 吸头吸取 750μl 上清液到吸附柱中。13000rpm 离心 30s，倒掉废液，进行后续洗涤/洗脱步骤。注意：植物组织的匀浆效果通常较动物组织差一些，所以一般推荐采用液氮条件下研钵来研磨。在采用钢珠研磨的条件下务必将组织研磨粉碎，否则会导致产率降低。病毒液 /体液 /血清 /血浆：吸取 150μl 病毒液/体液样品到加入到120μl RNA LB1 中，漩涡混合均匀 30s。直接加入 500μl RNA BB2中，漩涡混合均匀 15s。倒入吸附柱中，13000rpm 离心 30s，倒掉废液，进行后续洗涤/洗脱步骤。
培养细菌：收集菌体后，用 20~30μl 水重悬菌体（务必重悬充分），加入 120μl RNA LB1 漩涡混匀 30s，加入 500μl RNA BB2 上下颠倒混合均匀，倒入吸附柱中。13000rpm 离心 30s，倒掉废液，进行后续洗涤/洗脱步骤。
（2） 洗涤和洗脱
向吸附柱中加入 500μl Washing Buffer，13000rpm 离心 15s。重复此步骤一次。 将吸附柱重新放回离心机，13000rpm 空离心1min，将残留的乙醇甩干。 将吸附柱芯放入到 2mL NucleaseFree 收集管中，向吸附柱芯中加入 20~50μl Nuclease Free H2O，室温放置 1min，13,000rpm 离心 1min，洗脱液即为提取的 RNA，冷冻保存。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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