6min Fast 1st cDNA Synthesis Kit

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

描述：本试剂盒采用稳定高效的反转录预混体系 5×Fast RT MasterMix 进行 RNA 的反转录反应，使用时只需加入模板、 引物和 RNase Free H2O 即可，大大简化了操作过程、提高 了效率、减少了操作过程中的人为误差。 该预混体系包含快速 MLV7 反转录酶、dNTP、反应 Buffer 和 RNase Inhibitor。该试剂盒采用的 MLV7 反转录酶 具有以下特性：RNase H 活性缺失，从而避免反转录过程中 降解 RNA；经过突变文库筛选，使得其热稳定性更强，可耐 受 50℃ 高温反应，在 60℃ 条件下仍然具有 30%以上活性， 利于打开 RNA 二级结构，从而提高复杂 RNA 模板的扩增性 能；含有快速合成结构域，将 MLV 的延伸速度提高了 3-4 倍，因此适用于快速反转录反应；优化的反转录 Buffer 系统， 可以获得更高产量的 cDNA，从而提高后续检测的灵敏度。 合成的第一链 cDNA 可广泛用于 2nd Strand 的合成、杂交、 PCR 扩增、Real-Time PCR 反应等。

应用：
（1）该制品可有效反转录 mRNA、tRNA、LncRNA、ncRNA
（2）该制品不可反转录 microRNA
组分

储存：请置于-20°C，可保存 3 年；避免反复冻融。
1. 按以下组分配制反转录反应液
Total RNA or Poly(A) RNA 0.1-2 μg
5×Fast RT MasterMix 4 μl
*20×Oligo dT(25)&Random Primer 1 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
*注：反转录引物可根据需要改用特异性引物。
2.反应程序
 50°C 5 min（cDNA 合成）
 95°C 1 min（失活 MLV）
3. 采用 0.25-2μl 反转录产物，作为后续定量 PCR 或 PCR的扩增模板即可。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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