RNAclean RNA 清洁纯化试剂盒

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。 这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

公司正在出售的产品：鸭肝炎病毒通用探针法荧光定量PCR试剂盒Duck Hepatitis Virus(DHV)

鸭瘟病毒探针法荧光定量PCR试剂盒Duck Plague Virus(DPV)

大肠杆菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒(含致病性和非致病性)E.coli

细粒棘球绦虫探针法荧光定量PCR试剂盒Echinococcus granulosus

棘球绦虫通用探针法荧光定量PCR试剂盒Echinococcus spp.

鮰爱德华氏菌探针法荧光定量PCR试剂盒Edwardsiella ictaluri

爱德华氏菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒Edwardsiella spp.

迟钝爱德华菌探针法荧光定量PCR试剂盒Edwardsiella tarda

RT-1976(RT-76)鸡减蛋综合征病毒RT-1976探针法荧光定量PCR试剂盒Egg Drop Syndrome Virus-1976(EDSV-76)-1976

犬艾利希体（犬埃立克体）探针法荧光定量PCR试剂盒Ehrlichia canis

查菲艾利希体（查菲埃立克体）探针法荧光定量PCR试剂盒Ehrlichia chaffeensis

弗格森艾利希体（弗格森埃立克体）探针法荧光定量PCR试剂盒Ehrlichia fergusonii

里氏埃里希氏体探针法荧光定量PCR试剂盒Ehrlichia risticii

反刍兽艾利希体（反刍兽埃立克体）探针法荧光定量PCR试剂盒Ehrlichia ruminantium

艾利希体属（埃立克体属）通用探针法荧光定量PCR试剂盒Ehrlichiae spp.

啮蚀艾肯菌探针法荧光定量PCR试剂盒Eikenella corrodens

艾美耳球虫属通用探针法荧光定量PCR试剂盒Eimeria spp.

施氏油脂线虫探针法荧光定量PCR试剂盒Elaeophora schneideri

伊蒙微小菌探针法荧光定量PCR试剂盒Emmonsia parva

脑胞内原虫属通用·探针法荧光定量PCR试剂盒Encephalitozoon spp.

溶组织内阿米巴探针法荧光定量PCR试剂盒Entamoeba histolytica

内阿米巴通用探针法荧光定量PCR试剂盒Entamoeba spp. 

肠道腺病毒41型探针法荧光定量PCR试剂盒Enteric Adenovirus41

肠侵袭性大肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒Enterinvasive E.coli(EIEC)

肠粘附性大肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒Enteroadhesive E.Coli(EAEC)

产气肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒Enterobacter aerogenes

阴沟肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒Enterobacter cloacae

阪崎肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒Enterobacter sakazaki

肠杆菌属通用探针法荧光定量PCR试剂盒Enterobacter spp.

铅黄肠球菌探针法荧光定量PCR试剂盒Enterococcus casseliflavus

耐久肠球菌探针法荧光定量PCR试剂盒Enterococcus durans

粪肠球菌探针法荧光定量PCR试剂盒Enterococcus faecalis 

屎肠球菌探针法荧光定量PCR试剂盒Enterococcus faecium 

肠球菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒Enterococcus spp.

比氏肠微孢虫探针法荧光定量PCR试剂盒Enterocytozoon bieneusi 

虾肝肠微胞虫探针法荧光定量PCR试剂盒Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)

肠出血性大肠杆菌O104:H4血清型探针法荧光定量PCR试剂盒Enterohemorrhagic E. coli(EHEC)

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。