RNAfixer 无液氮 RNA 样品储存液

商品属性：

保存条件：

室温(18-25℃)保存1 年以上，如果使用时发现有沉淀或者析出，可以37℃水浴加热重新溶解后使用，重新溶解后不会影响产品质量。
产品介绍：
RNAfixer 是一种液态的无毒的组织保存液体，可以迅速渗入新鲜组织细胞的胞浆中，在非冻状态下原位稳定和保护细胞内的RNA。取下组织薄片后立刻浸入RNAfixer 保存并不影响将来提取RNA 的质量和数量。RNAfixer 消除了RNA 样品需要立刻处理或者必须液氮保存的不方便。浸入RNAfixer 后，新鲜组织细胞中RNA 可以完好的在37℃下保存一天，在25℃下保存一周，4℃下保存一个月，在-20℃或-80℃下长期保存。
RNA 病毒样品(如HCV 和HIV)可在37℃保存一个月。适用于动物组织（心、肝、肾、肌肉、睾丸、脑、脾等）、培养细胞、RNA 病毒、 果蝇、细菌、白细胞、一些植物组织等。
产品特点：
1.操作容易：将组织成适当大小，浸没在RNAfixer 中即可使其RNA 不被降解。
2.无需液氮：使样品的保存不需液氮,干冰或-80℃冰箱,尤其适用于临床和野外样品的快速和大规模采集。
3.方便运输：处理过的样品能在25℃保存一周,使样品邮寄和运输变得容易和便宜,有利学术合作和交流。
4.多次冻融: 经RNAfixer 处理的样品可反复冻融多次, 其间可对样品进行各种处理而不影响最终提取的RNA 的质量。
5.可比性强: RNAfixer 能减少大规模样品处理中的误差,增加各次实验数间的可比性, 对大规模基因表达谱的分析尤其有用。
使用说明：
RNAfixer 只用于新鲜组织，浸泡入 RNAfixer 前禁止冷冻组织。只需要迅速将新鲜组织成长、宽，高任意一边厚度<0.5 厘米浸泡入 RNAfixer 即可（只要有一边厚度不超过 0.5 厘米，RNAfixer 可以迅速渗透，其它两边的尺寸并不重要）。将新鲜组织浸泡 在 5 倍体积的 RNAfixer 中，按照指示存放在适当的温度。
1.动物组织 RNAfixer 并不破坏或者溶解组织结构，因此浸泡在 RNAfixer 中达到渗透平衡的组织 可以从 RNAfixer 中取出，然后切成更小的块，然后放回到 RNAfixer 中下次继续使用。小器官如小鼠肝、肾、脾不需要剪切,可以完整的存放在 RNAfixer 中。
推荐不同组织样品的 RNAstore 使用量：

 2.植物组织很多植物组织直接浸泡入 RNAfixer 即可，有的植物有天然渗透屏障如腊质保护层，需要先破坏掉腊质层,便于 RNAfixer 渗透。
3.组织培养细胞细胞吹打下来后,离心收集细胞,弃上清，用冰浴的 PBS 缓冲液洗一次去除残留培养液。将细胞悬浮在少量 PBS 缓冲液中。加入五到十倍体积 RNAfixer, 混均。
4.白细胞对于全血中白细胞的保存，需将白细胞从红细胞和血清中分离出来，并按组织培养细胞一样处理后，白细胞便能有效地保存在 RNAfixer 中。不要将全血、血浆或血清中的 RNA 保存在 RNAfixer 中，因为它们蛋白含量过高，与 RNAfixer 混合后易形成不溶的沉淀。
5.细菌
细菌并不能在 RNAfixer 中生长，但是 RNAfixer 并不破坏细菌，E. coli 在 4℃保存一个月仍旧可以提出完整的 RNA。
RNAfixer 中样本的存放：
1.存放在-80℃样品长期保存用。将 RNA fixer 中样本放置于 4℃过夜，然后将样本捞出，尽量去除干净 RNAfixer 液体，然后放置于-80℃。对于组织培养细胞，则不需要去除RNAfixer，直接冷冻于-80℃，并不会裂解细胞。样品使用时可以在室温融化，并且还可以再次冷冻而不影响 RNA 的完整性和产量。
2.存放在-20℃将 RNAfixer 中样本放置于 4℃过夜，然后转移到-20℃。在-20℃样品并不会被冰冻,但是可能会形成一些结晶，这并不会影响将来的 RNA 提取。样品使用时可以在室温 融化，并且还可以再次冷冻而不影响 RNA 的完整性和产量。
3.存放在 4℃样本可以在 4℃存放一个月。
4.存放于 25℃存放于 25℃样本的 RNA 在一周内保持完整，保存两周的样品 RNA 有轻微降解，勉强能用于northern analysis, 但是质量足够用于nuclease protection assay or RT-PCR 。
5.存放于 37℃存放于 37℃样本的 RNA 在 24 小时内保持完整，3 天的时候有部分降解。RNAfixer 保存样本的 RNA 提取：将样本从 RNAfixer 中取出,RNAfixer 可以直接倒入水池，用自来水冲即可，不需特殊处理。
1.组织
用干净镊子将样本从 RNAfixer 中捞出，用吸水纸稍稍吸去残留的 RNAfixer 后，可以和新鲜组织一样按照液氮研磨，然后匀浆处理的标准程序进行提取 RNA。
2.细胞
对于储存在 RNAfixer 中的细胞有两种选择。一是去除 RNAfixer 后提取 RNA, 另一个是直接从细胞和 RNAfixer 的混合物提取。
1）去除 RNAfixer 后提取 RNA存放于 RNAfixer 中的细胞变得不那么脆弱，可以承受较高的离心速度而不被裂解。 我们有在 5000g 离心成功收集细胞的经验，由于每种细胞的强度不一样，可以先用不重要的细胞做个预试验，以保证在使用的速度下离心不会破坏细胞。另一个选择是在离心前加等体积的 PBS 稀释 RNAfixer 和细胞的混合物，以减少溶液的密度，使细胞溶液可以沉淀下来。
2）不去除 RNAfixer，直接提取 RNA
也可以直接加 10 倍体积的一步法提取试剂（如 TRIpure，TRI reagent）到细胞和RNAfixer 的混合物，然后按照正常步骤操作。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

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PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。