RNAfixer 无液氮 RNA 样品储存液公司正在出售的产品:鸭胚肝间质细胞(永生化) G蛋白偶联嘌呤受体p2y12封闭多肽 灭鲑气单胞菌PCR检测试剂盒 大鼠胶原酶I(Collagenase I)ELISA检测试剂盒 6磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)酶活性比色法检测试剂盒 常现青霉 卷曲螺旋结构域蛋白25抗体
更新时间:2024-01-12
商品属性:
产品名称 | 规格 | 货号 |
RNAfixer 无液氮 RNA 样品储存液 | 100ml | A-Hc2011 |
保存条件:
室温(18-25℃)保存1 年以上,如果使用时发现有沉淀或者析出,可以37℃水浴加热重新溶解后使用,重新溶解后不会影响产品质量。
产品介绍:
RNAfixer 是一种液态的无毒的组织保存液体,可以迅速渗入新鲜组织细胞的胞浆中,在非冻状态下原位稳定和保护细胞内的RNA。取下组织薄片后立刻浸入RNAfixer 保存并不影响将来提取RNA 的质量和数量。RNAfixer 消除了RNA 样品需要立刻处理或者必须液氮保存的不方便。浸入RNAfixer 后,新鲜组织细胞中RNA 可以完好的在37℃下保存一天,在25℃下保存一周,4℃下保存一个月,在-20℃或-80℃下长期保存。
RNA 病毒样品(如HCV 和HIV)可在37℃保存一个月。适用于动物组织(心、肝、肾、肌肉、睾丸、脑、脾等)、培养细胞、RNA 病毒、 果蝇、细菌、白细胞、一些植物组织等。
产品特点:
1.操作容易:将组织成适当大小,浸没在RNAfixer 中即可使其RNA 不被降解。
2.无需液氮:使样品的保存不需液氮,干冰或-80℃冰箱,尤其适用于临床和野外样品的快速和大规模采集。
3.方便运输:处理过的样品能在25℃保存一周,使样品邮寄和运输变得容易和便宜,有利学术合作和交流。
4.多次冻融: 经RNAfixer 处理的样品可反复冻融多次, 其间可对样品进行各种处理而不影响最终提取的RNA 的质量。
5.可比性强: RNAfixer 能减少大规模样品处理中的误差,增加各次实验数间的可比性, 对大规模基因表达谱的分析尤其有用。
使用说明:
RNAfixer 只用于新鲜组织,浸泡入 RNAfixer 前禁止冷冻组织。只需要迅速将新鲜组织成长、宽,高任意一边厚度<0.5 厘米浸泡入 RNAfixer 即可(只要有一边厚度不超过 0.5 厘米,RNAfixer 可以迅速渗透,其它两边的尺寸并不重要)。将新鲜组织浸泡 在 5 倍体积的 RNAfixer 中,按照指示存放在适当的温度。
1.动物组织 RNAfixer 并不破坏或者溶解组织结构,因此浸泡在 RNAfixer 中达到渗透平衡的组织 可以从 RNAfixer 中取出,然后切成更小的块,然后放回到 RNAfixer 中下次继续使用。小器官如小鼠肝、肾、脾不需要剪切,可以完整的存放在 RNAfixer 中。
推荐不同组织样品的 RNAstore 使用量:
2.植物组织很多植物组织直接浸泡入 RNAfixer 即可,有的植物有天然渗透屏障如腊质保护层,需要先破坏掉腊质层,便于 RNAfixer 渗透。
3.组织培养细胞细胞吹打下来后,离心收集细胞,弃上清,用冰浴的 PBS 缓冲液洗一次去除残留培养液。将细胞悬浮在少量 PBS 缓冲液中。加入五到十倍体积 RNAfixer, 混均。
4.白细胞对于全血中白细胞的保存,需将白细胞从红细胞和血清中分离出来,并按组织培养细胞一样处理后,白细胞便能有效地保存在 RNAfixer 中。不要将全血、血浆或血清中的 RNA 保存在 RNAfixer 中,因为它们蛋白含量过高,与 RNAfixer 混合后易形成不溶的沉淀。
5.细菌
细菌并不能在 RNAfixer 中生长,但是 RNAfixer 并不破坏细菌,E. coli 在 4℃保存一个月仍旧可以提出完整的 RNA。
RNAfixer 中样本的存放:
1.存放在-80℃样品长期保存用。将 RNA fixer 中样本放置于 4℃过夜,然后将样本捞出,尽量去除干净 RNAfixer 液体,然后放置于-80℃。对于组织培养细胞,则不需要去除RNAfixer,直接冷冻于-80℃,并不会裂解细胞。样品使用时可以在室温融化,并且还可以再次冷冻而不影响 RNA 的完整性和产量。
2.存放在-20℃将 RNAfixer 中样本放置于 4℃过夜,然后转移到-20℃。在-20℃样品并不会被冰冻,但是可能会形成一些结晶,这并不会影响将来的 RNA 提取。样品使用时可以在室温 融化,并且还可以再次冷冻而不影响 RNA 的完整性和产量。
3.存放在 4℃样本可以在 4℃存放一个月。
4.存放于 25℃存放于 25℃样本的 RNA 在一周内保持完整,保存两周的样品 RNA 有轻微降解,勉强能用于northern analysis, 但是质量足够用于nuclease protection assay or RT-PCR 。
5.存放于 37℃存放于 37℃样本的 RNA 在 24 小时内保持完整,3 天的时候有部分降解。RNAfixer 保存样本的 RNA 提取:将样本从 RNAfixer 中取出,RNAfixer 可以直接倒入水池,用自来水冲即可,不需特殊处理。
1.组织
用干净镊子将样本从 RNAfixer 中捞出,用吸水纸稍稍吸去残留的 RNAfixer 后,可以和新鲜组织一样按照液氮研磨,然后匀浆处理的标准程序进行提取 RNA。
2.细胞
对于储存在 RNAfixer 中的细胞有两种选择。一是去除 RNAfixer 后提取 RNA, 另一个是直接从细胞和 RNAfixer 的混合物提取。
1)去除 RNAfixer 后提取 RNA存放于 RNAfixer 中的细胞变得不那么脆弱,可以承受较高的离心速度而不被裂解。 我们有在 5000g 离心成功收集细胞的经验,由于每种细胞的强度不一样,可以先用不重要的细胞做个预试验,以保证在使用的速度下离心不会破坏细胞。另一个选择是在离心前加等体积的 PBS 稀释 RNAfixer 和细胞的混合物,以减少溶液的密度,使细胞溶液可以沉淀下来。
2)不去除 RNAfixer,直接提取 RNA
也可以直接加 10 倍体积的一步法提取试剂(如 TRIpure,TRI reagent)到细胞和RNAfixer 的混合物,然后按照正常步骤操作。
PCR基本步骤及注意事项?
一、实验原理
PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
二、主要的成分
1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。
注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。
2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。
公司正在出售的产品:
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地榆染料法PCR鉴定试剂盒 | 表皮角蛋白ELISA试剂盒 EK免费代测试剂 | 单纯疱疹病毒1型PCR检测试剂盒直销 |
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犬腺体病毒1型(犬传染性肝炎病毒)探针法荧光定量PCR试剂盒 | 丛状蛋白A2ELISA试剂盒 | 乙型肝炎病毒耐药PCR检测试剂盒 |
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利什曼原虫通用探针法荧光定量PCR试剂盒 | 蛋白C抑制因子ELISA试剂盒 | 马立克氏病病毒2型PCR检测试剂盒 |
立克次氏体通用PCR试剂盒 | 蛋白酪磷酸酶样蛋白AELISA试剂盒 | 蜜蜂微孢子虫通用PCR检测试剂盒直销 |
犬链球菌探针法荧光定量PCR试剂盒 | 动力蛋白激活蛋白3ELISA试剂盒 | 耐万古肠球菌PCR检测试剂盒 |
柯萨奇病毒 A2 型 / 柯萨奇病毒 A4 型核酸检测试剂盒( 双重荧光 PCR 法 ) | 人核因子κB(NF-κB)ELISA试剂盒 | 牛附红细胞体探针法荧光定量PCR试剂盒 |
禽病毒H10N8亚型PCR检测试剂盒(荧光PCR法) | 人基质金属蛋白酶2/明胶酶A(MMP-2/GelatinaseA)检测试剂盒elisa | 禽腺病毒C型探针法荧光定量PCR试剂盒 |
RNAfixer 无液氮 RNA 样品储存液鹌鹑奇异线虫探针法荧光定量PCR试剂盒 | 人钙联蛋白(calnexin)试剂盒ELISA | 黄绿青霉探针法荧光定量PCR试剂盒 |
产酸克雷伯菌PCR检测试剂盒 | 人MAX二聚化蛋白1(mxd1)试剂盒 ELISA | 热带念珠菌探针法荧光定量PCR试剂盒 |
豌豆内源基因PCR检测试剂盒 | 人白介素33(IL-33)ELISA试剂盒 | 牛分枝杆菌卡介苗探针法荧光定量PCR试剂盒 |
PCR实验中应该注意的问题有哪些?
没有ct值
检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:
1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);
2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;
4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;
5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
ct值过晚
在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;
2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);
3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。