pUC57 Simple TA/平端通用克隆载体

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

描述：pUC57 Simple 通用克隆载体采用了 TOPO 酶连接技术，载体预先偶联上 TOPO 酶，当加入 PCR 扩增产物后，5 min 就可以完成连接反应，连接阳性率高。pUC57 Simple 通用克隆载体消除了大部分的常用酶切位点，便于后续亚克隆。该产 品适用于 Taq 酶扩增的含“A"尾巴和高保真酶扩增的 PCR 产物的连接，载体含有氨苄青霉抗性筛选标记。 

注意：RTS DH5α 冻干感受态在未溶解状态下，可于-20℃长期保存（>2 年），已经溶解后，请-60℃以下保存（3 个月）。
主要特征
（1）快速连接，最快仅需 5min；（2）操作简单，仅需加入载体和片段即可；（3）无需蓝白斑筛选，阳性率高；（4）不包含
任何酶切位点，便于后续亚克隆（5）平末端和 A 尾产物通用。
注意：引物不能磷酸化。
测序引物
正向测序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；
反向测序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；
操作步骤
1. PCR 产物的纯化
1.1 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如无非特异性扩增、无引物二聚体、条带单一明亮，则可采用 PCR 产物纯化试剂
盒纯化后用于连接。产物不经纯化也可以进行连接，但效果稍差一些。
1.2 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如有非特异性扩增条带或引物二聚体，则必须采用胶回收后用于连接。
1.3 PCR 扩增模板来源于 Amp 抗性质粒，则必须采用胶回收后用于连接。
2. PCR 用量和连接时间
PCR 产物大小 PCR 产物用量 载体用量 摩尔比 连接时间 阳性率
0.1~1kb 2～10ng 1 μl 1: 5~10 5～10min >95%
1~3kb 10～20ng 1 μl 1: 5~10 15～20min >90%
>3kb 5ng/kb 1 μl 1: 5~10 30min >85%
3. 连接反应
向 0.2 ml EP 管中依次加入如下试剂
成 分 用 量
PCR 产物 0.5~4 μl （用量参考上表）
pUC57 Simple Vector 1 μl
加无菌水至总体积为 5 μl
轻轻吹打混合均匀后，室温（25°C）孵育 5～30min，通常放置 10min。
关于 PCR 产物的用量说明：在 PCR 产物回收后（在无法进行 NanoDrop 测定浓度的情况下），按照一般的经验可估算产物
的用量，原则为：3 μl 回收产物在琼脂糖凝胶电泳后，可清晰判断的情况下，使用 0.5~1 μl 回收产物（约 5~15 ng）进行连
接即可。回收产物难以观察的情况下使用 4 μl 回收产物（约 5~10 ng）进行连接。使用过高量的 PCR 产物将会导致连接效
率低下，长斑数量和阳性率急剧下降。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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