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T4 DNA 连接酶

简要描述:

T4 DNA 连接酶公司正在出售的产品:中华鳖肺成纤维细胞 锌指蛋白187封闭多肽 中华枝睾吸虫PCR检测试剂盒 大鼠生长激释放多肽(GHRP)ELISA检测试剂盒 葡萄糖脱氢(GCDH)活性比色法检测试剂盒 假交替单胞菌 19号染色体开放阅读框18抗体

更新时间:2024-01-12

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T4 DNA 连接酶

商品属性:

产品名称

规格

货号

T4 DNA 连接酶

35KU

A-PJ1087

QQ截图20240110094643.jpg

描述:T4 DNA Ligase 可催化相邻 DNA 链的 5’-P 末端和 3’-OH 末端以磷酸二酯键结合的反应,需 ATP 作辅酶,不仅 可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的 DNA 的连接,也 可以催化 DNA 与 RNA 之间以及少数 RNA 之间的连接。可 应用于在粘性末端或平末端连接双链 DNA 分子,也可应用 于修补双链 DNA、RNA 或 DNA RNA 杂交体上的缺口。

组分

储存:-20°C 可保存 2 年。
活性定义:16°C 反应 30 分钟条件下,使 1pmol 的粘性末端
DNA 连接所需要的酶量定义为 1Unit。
失活:65°C,10 分钟。
10×T4 Ligase Buffer:500 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mMMgCl2, 25mM DTT, 5mM ATP.
操作方法
1. 按以下组分配制反应体系
10×T4 Ligase Buffer 2 μl
载体 50 ng(0.2-1pmol)
插入片段 1-50 ng(0.2-10pmol)
T4 DNA Ligase(200 U/μl) 1 μl
ddH2O Up to 20 μl
注意:两个片段的连接时,通常载体与插入片段的摩尔比为1:3(但该比例并非绝对严谨,在 1:1-1:10 范围内均可获得理想的实验结果),提取根据片段大小与浓度,计算其摩尔浓度。
2. 如为粘末端连接反应, 22°C (16-37°C)连接 30min,连接产物直接用于转化(或冻存于-20°C)。


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PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

公司正在出售的产品:

诺如病毒G4型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

白介1RαELISA试剂盒 IL-1Rα免费代测试剂

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禽白血病病毒H亚群染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

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二羟基赖正己氨ELISA试剂盒

鲤疱疹病毒2PCR试剂盒

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诺卡菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒

葡萄孢菌PCR检测试剂盒供应

纺锤体蛋白3ELISA试剂盒

马类圆线虫探针法荧光定量PCR试剂盒

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人蛋白水解诱导因子/皮离蛋白(PIF/DCD)ELISA试剂盒

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牛莫拉氏菌PCR检测试剂盒说明书

α半乳糖基抗体(Gal)检测试剂盒elisa

革兰氏阴性细菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒

肠出血性大肠杆菌O104:H4血清型探针法荧光定量PCR试剂盒

人脱氢E1(PDH E1)试剂盒ELISA

蛙病毒PCR检测试剂盒

鸟分枝杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

β-防御3 试剂盒ELISA

T4 DNA 连接酶肠侵袭性大肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

肉毒杆菌F型(CB-F)核检测试剂盒

人雌激诱导蛋白PS2 试剂盒 ELISA

禽传染性支气管炎病毒荷兰株PCR检测试剂盒