Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

对目的蛋白进行检测分析时，总蛋白的提取至关重要，如蛋白提取不好会导致后续试验的不理想甚至失败，如：信号极弱或无杂交信号、背景高、非特异性条带多等.根据目标蛋白的类型和实验应用种类来选择合适的RIPA裂解液，才能程度地保证后续实验的成功。 Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer对细胞有一定的裂解能力，能获得较多的胞浆蛋白，而对细胞核的裂解能力有限，不能裂解细胞核，因此获得的总蛋白适用于IP或CO-IP实验；而WB Super RIPA Lysis Buffer对动物组织和细胞的裂解能力强，它可以裂解细胞核和线粒体，并可提取到更多的膜蛋白，从而可获得更多的总蛋白。因其强的裂解能力，使得大量的基因组DNA从细胞核中释放出来，使蛋白变的十分粘稠，使用Benzonase核酸酶消化可有效解决。经RIPA裂解液获得得蛋白可用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度；使用Bradford法测定由本裂解液裂解所得到样品的蛋白浓度会稍有误差。
1.可很好的释放胞浆蛋白，部分释放膜蛋白和核蛋白。 2.经Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer，核蛋白与DNA还紧密 结合在一起，离心后会造成核蛋白的丢失。 3.对于膜蛋白，Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer的破坏力 小，不能使膜蛋白与膜充分分离，故离心后造成膜蛋白 的丢失。 4.在提取蛋白过程中，基因组DNA释放使得蛋白提取液 变的十分粘稠，影响蛋白电泳和杂交效果。		1.可以很好的裂解细胞膜及细胞核，从而更好的释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白。 2.对于核蛋白，经WB Super RIPA Lysis Buffer裂解后，核蛋白与粘稠的基因组DNA分离，离心后核蛋白存在于上清中，核蛋白的捕获率高达90%。 3.对于膜蛋白，WB Super RIPA Lysis Buffer可大程度的破坏细胞膜和变性蛋白，使蛋白与膜分离，防止蛋白与膜复合物在离心后沉淀，从而防止蛋白丢失。 4.在提取蛋白过程中，基因组DNA释放使得蛋白提取液变的十分粘稠，使用Benzonase核酸酶消化可有效解决。
储存
置于室温阴凉处，可保存2年。
实例
Fig.用WB Super RIPA Lysis Buffer和Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer分别提取核蛋白PPARγ和膜蛋白PLD-1，上样量分别为40ug和10ug总蛋白，ECL发光液显色。A/C泳道为WB Super RIPA Lysis Buffer，B/D泳道为Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer。由此图比较分析表明WB Super RIPA Lysis Buffer能更充分的释放核蛋白和膜蛋白，从而获得更强的信号。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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