ssDNA/RNA环化连接酶

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描述： ssDNA/RNA CircLigase 为热稳定的 DNA/RNA 连接 酶，不依赖于 ATP，可催化单链 DNA 或单链 RNA 的分子内 环化。环化反应中，要求催化底物单链 DNA/RNA 具有 5’- 磷酸基团和 3’-OH 基团。对于大于 15nt 的单链底物，该酶 都能高效的连接。 

组分

活性定义：65°C 1h 条件下，催化 1pmol 5’-磷酸化的 ssDNA
底物环化，所需的酶量定义为 1Unit。
储存：-20℃可保存 3 年。
反应实例
1. 按以下组分配制反应液
CircLigase (100 U/μl) 1 μl
5’磷酸化 ssDNA/RNA 10-100 pmol
10×CircLigase Buffer 2 μl
50mM MnCl2 1 μl
ddH2O Up to 20 ul
65°C 孵育 1h 进行环化反应。
2. 失活反应
反应结束后，可加入终浓度 10mM EDTA 终止反应。或采用
加热方式 85℃ 10min 加热失活。
使用注意事项：
(1) 环化底物 ssDNA 或 RNA 必须带有 5’磷酸基团，3’端含有 OH。
(2) 环化体系中的 ATP 浓度高于 20μM 以上时会极大抑制环化效率，甚至导致环化失败。因此建议底物为纯化产物。
(3) 由于本酶提高了耐热性，在 65℃条件下进行连接反应，在测试中 Betain 无益于连接效率提升。
(4) 本酶主要进行分子内环化连接，分子间的连接未检测到。
(5) 本酶对 ssDNA 和 RNA 的环化效率高，多数情况下，90%以上的底物被环化。未被环化的 ssDNA 可通过加入 5U的 Exonuclease I，37°C 消化 15min 去除，以获得高纯度的环化 ssDNA。未环化的 ssRNA，将稍后给出去除方案。
(6) 本酶可以连接 15nt 以上的核苷酸，更长的产物连接参数，将稍后给出测试报告及 protocol。
(7) 对于连接底物量较少的实验来讲，推荐缩小体系，而不是减少酶的用量。在小体系实验时注意体系的蒸发，可加入矿物油以防止蒸发。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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