Bst 4.0 Basic Mix (液体预混)

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

该制品为单一组分的 MasterMix（2 倍浓度），包含了反应缓冲液、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，使用时只需要加入引物、模板即可进行核酸恒温扩增。Bst4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依赖于 RNA 模板的聚合酶活性（逆转录），还具有依赖于 DNA 的聚合酶活性，因此无论DNA 或 RNA 样本均可使用该制品进行高效的恒温扩增。该制品是进行 LAMP 及 RT-LAMP 扩增反应的试剂。优化的反应体系，确保快速的完成检测试剂的反应体系建立。该系列产品不包含任何其它辅助染料，在 LAMP 的扩增搭配 OG 橙绿变色管进行可视化变色反应。除此外，该制品还可以用于其它恒温扩增实验，包括 CPA、SMAP 等。
储存：长期保存制品于-20℃，保存 2 年。
使用实例（以 LAMP OG 橙绿变色为例）橙绿变色染料（OG Dye）以冻干的形式预加在 8 联管盖上。在 LAMP 反应完毕后（在反应完毕前，务
必不能将管盖上染料混入反应液中），将 0.2ml EP 管颠倒溶解 OG 染料后。LAMP 的反应产物将与 OG 染料形成强烈的绿色肉眼可见变色反应（阳性），而未发生扩增的 EP管为深橙色（阴性）。
（1）配制反应体系
在 0.2ml EP 反应管中加入下述试剂
2xBst 4.0 Basic Mix 10 μl
*10xLAMP Primer Mix 2 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到总体积 20 μl
*10xLAMP Primer Mix 浓度：FIP/BIP 分别为 16 μM、LoopF/B 分别为 4 μM、F3/B3 分别为 2 μM全部试剂加入完毕后，轻弹 EP 管底部后，再盖上 OG 橙绿变色管（盖上管盖后务必不能再剧烈混合与倒置，以防止将管盖上的 OG 染料溶解，OG 染料一旦混入反应液中将会终止 LAMP 反应）。
实验 LAMP Primer Mix 分别采用 1、1.5、2 μl，以阴性不变色，阳性样品正常变色为标准，作为后续测试用量。
（2）反应体系配好后，置于 60~68°C（实验采用65°C）进行反应 20~45min。（扩增良好的引物组合，通常 25min 即可变色，一般不超过 45min，实验设置20、25、30、45min）。
（3）观察结果：观察结果时，尽可能不要与配制反应空间共用，以防止污染操作台。将反应 EP 管倒置，并手腕轻甩，反应液浸泡 EP 管盖上的 OG 染料，静置 30s。再将 EP 反应管正置，并轻甩反应液到 EP 管底部，此时扩增样品将变为鲜艳肉眼可见绿色，而阴性未发生扩增的管将为深橙色。
注意事项
1. 在用于其它恒温扩增反应时（如 CPA、SMAP 等），可参考如上策略进行使用，反应时间可能会需要调整。
2. 关于矿物油的使用，在配制完 LAMP 反应体系后，可加入一滴矿物油覆盖于反应液上部，以减少气溶胶的污染。
3. 鉴于特殊的生产工艺， 全系恒温扩增 Mix 系
列均不能进行浊度分析。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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