Bst 4.0 Basic Bead

商品属性：

该制品为全体系冻干微球制品，内含恒温扩增所用的反应缓冲液、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，其不包含任何染料，使用时只需要加入引物、模板即可进行核酸恒温扩增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依赖于 RNA 模板的聚合酶活性（逆转录），还具有依赖于DNA 的聚合酶活性，因此无论 DNA 或 RNA 样本均可使用该制品进行恒温扩增。该制品是进行 LAMP 及RT-LAMP 扩增反应的试剂。
本制品不包含任何显色染料，可自行搭配相关染料或检测手段进行 LAMP 反应，包括搭配 OG 染料管进行橙绿变色、搭配标记 Oligo 进行试纸条检测、搭配荧光染料进行荧光检测、搭配 Molecular Beacon 探针进行荧光检测等方法。
储存：-20℃保存 2 年；室温（25℃）保存>6 个月。
使用方法：（进行 LAMP 橙绿变色扩增）：
1. 关于 OG 橙绿变色管说明：橙绿变色染料（OG Dye）以烘干的形式预加在8联管盖上。LAMP反应完毕后，将 0.2ml EP 管颠倒溶解 OG 染料后。LAMP的反应产物将与 OG 染料形成绿色肉眼可见变色反应（阳性），而未扩增的 EP 管为深橙色（阴性）。本试剂管常温长期保存。
2. 配制变色 LAMP 反应体系
在 OG 染料管（0.2ml EP）反应管中加入下述试剂
Bst4.0 Basic Bead 1 粒
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到总体积 25 μl
10xLAMP Primer Mix 浓度：FIP/BIP 分别为 16 μM、
注意：全部试剂加入完毕后，轻弹 EP 管底部后，再盖上 OG 橙
3. 反应体系配好后，置于 65°C 进行反应 15~30min。（扩增良好的引物组合，通常 20min 即可变色，一般不超过30min）。
4. 观察结果：反应结束后，从加热装置中将反应管取出，室温 2min，使整个反应管冷却下来。再次用力将反应管
注意：
（1）观察结果时，尽可能不要与配制反应空间共用，以防止污染操作台。
（2）尽管  选取的为高密封
注意事项：
（1）关于矿物油的使用，在配制完 LAMP 反应体系后，可加入一滴矿物油覆盖于反应液上部，以减少气溶胶的污
（2）在使用其它荧光染料时，使用浓度可自行优化，通染料可能导致扩增失败。
（3）本试剂不支持，浊度、pH 变色、HNB 变色反应，请勿尝试。
（4）关于 LAMP 成品试剂的建议， Bst 4.0 Basic Bead冻干球和 OG 橙绿变色管均为室温稳定状态，可长期保存。将扩增引物加入到 OG 橙绿变色管底部，于 70°C 烘干，再加入一粒冻干球即可制备成全体系检测试剂。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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