Bst 2.0 DNA聚合酶(8U/ul)公司正在出售的产品:人胃腺癌细胞 细胞色c氧化IV亚型1封闭多肽 达氏疏螺旋体PCR检测试剂盒 大鼠内毒(ET)ELISA Kit 果胶活性比色法检测试剂盒 东方无形杆菌 环指蛋白113B抗体
更新时间:2024-01-12
商品属性:
产品名称 | 规格 | 货号 |
Bst 2.0 DNA聚合酶(8U/ul) | 1600U | A-PJ1001 |
Bst 2.0 DNA聚合酶(8U/ul) | 16KU | A-PJ1001 |
描 述 :
该 酶 来 源 于 Bacillus stearothermophilus DNAPolymerase I,通过基因工程手段去除了其 5’-3’外切酶活性,而保留了 5’-3’聚合酶活性。该酶具有很强的链置换能力,因此是 Isothermal amplification (LAMP, RT-LAMP)的用酶。与野生型 Bst DNA 聚合酶(大片段)相比,该酶在扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等方面均有大幅提高,同时,该酶可以使用 dUTP 作为底物进行扩增(Bst 大片段无此活性)。
单位定义
一个活力单位即在 65°C 条件下,30 分钟内催化 10 nmoldNTP 的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。
应用:
DNA 等温扩增
富含 GC 结构的快速测序
微量模板 DNA 的快速测序
失活:
85°C,5min 失活。
储存:-20℃可保存 3 年。
典型的 LAMP 反应
1. 按以下组分配制 LAMP 反应液
Bst 2.0 DNA Polymerase ( 8 U/μl) 0.25~1 μl
10×Isothermo Buffer(Mg2+ free) 2.5 μl
100 mM Mg2+
X μl
dNTP Mixture (10 mM each) 3.5 μl
模板 DNA 10 ng~1 μg
*10X Primers 2.5 μl
ddH2O Up to 25 μl
*10X Primers:16 μM FIP/BIP, 2 μM F3/B3, 4-8 μM LpF/B each。
2. 65°C 30~60min; 85°C 5min 失活。
使用注意事项:
(1) Mg2+的使用浓度为 4~10 mM 浓度,Isothermo Buffer中没有 Mg2+,通常情况下,在 6-8mM Mg2+条件下可获得较好的 LAMP 结果。
(2) 有文献报道加入 Tte Uvrd 解旋酶可改善 LAMP 的效果。
(3) 使用无模板 DNA 作为对照检测扩增的特异性。
PCR基本步骤及注意事项?
一、实验原理
PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
二、主要的成分
1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。
注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。
2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。
PCR实验中应该注意的问题有哪些?
没有ct值
检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:
1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);
2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;
4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;
5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
ct值过晚
在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;
2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);
3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
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