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Bst 4.0 SYBR Green Bead

简要描述:

Bst 4.0 SYBR Green Bead公司正在出售的产品:前列腺癌细胞 磷化p21激活激6封闭多肽 牛疱疹病毒通用PCR检测试剂盒 大鼠内脂/内脏脂肪(visfatin)ELISA检测试剂盒 过氧化物(POD)活性比色法检测试剂盒 黏着剑菌 脑蛋白4抗体

更新时间:2024-01-12

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Bst 4.0 SYBR Green Bead

商品属性:

产品名称

规格

货号

Bst 4.0 SYBR Green Bead

100Tx25μl

A-PJ1011


该制品为全体系冻干微球制品,内含恒温扩增所用的反应缓冲液、SYBR Green 荧光染料、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等,使用时只需要加入引物、模板即可进行核酸恒温扩增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依赖于 RNA 模板的聚合酶活性(逆转录),还具有依赖于 DNA 的聚合酶活性,因此无论 DNA 或 RNA 样本均可使用该制品进行恒温扩增。该制品是进行 LAMP 及RT-LAMP 扩增反应的试剂。
SYBR Green 系列产品为实时荧光检测的专用试剂,可直接在恒温荧光仪或定量 PCR 以上进行 LAMP 反应扩增。
储存:-20℃保存 2 年;室温(25℃)保存>6 个月。
使用冻干微球进行全扩增体系用品的制备方法:将优化的扩增引物分装于 0.2 ml EP 管底部,于 70-80℃条件烘干1-2h。烘干后的 0.2 ml EP 管已经含有干燥的扩增引物,再加入一粒冻干微球即可制备成全扩增体系干燥品,该干燥品无需冷链运输,可长期保存。
反应体系说明:每一个冻干微球为按照 25 μl 反应体系建立,在使用时只需要加入 25 μl 的 ddH2O 或模板即可进行反应。
使用实例,进行 LAMP 荧光扩增
1. 配制荧光 LAMP 反应体系在 0.2 ml EP 反应管中加入下述试剂
Bst 4.0 SG Bead 1 粒
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到液体总量 25 μl
10xLAMP Primer Mix 浓度:FIP/BIP 分别为 16 μM、LoopF/B 分别为 4-8 μM、F3/B3 分别为 2 μM。
2. 反应体系配好后,置于荧光定量 PCR 仪中于 65°C进行反应 15~30min。1min 收集一次荧光信号。读取扩增曲线进行阴性和阳性判读。
3. 根据荧光扩增曲线判读阳性和阴性。
QQ截图20240110094643.jpg注意事项:
(1)关于矿物油的使用,在配制完 LAMP 反应体系后,可加入一滴矿物油覆盖于反应液上部,可以有效的减少气溶胶的污染。实验证明矿物油并不影响机器的荧光数值读取。
(2)关于扩增曲线的异常:由于 LAMP 扩增速度较快,荧光信号读取可能存在矫正计算问题,这与荧光设备的软件算法有管。在有些荧光 PCR 仪上,在相对荧光模式下,表现出曲线飞峰、终点曲线下降的问题。此时调整到原始荧光值模式下观察结果,或致电相应设备供应商进行咨询。

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PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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