Bst 4.0 HNB Bead公司正在出售的产品:膀胱癌 分泌载体膜蛋白3封闭多肽 牛疱疹病毒型PCR检测试剂盒 大鼠尿激(UK)ELISA试剂盒 还原糖含量活性比色法检测试剂盒 蒙氏假单胞菌 PGBD3蛋白抗体
更新时间:2024-01-12
公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断!
货号 | 产品名称 | 规格 |
A-PJ1012 | Bst 4.0 HNB Bead | 100T(25ul体系) |
本品为全组分冻干品试剂,包含了标准反应缓冲液、HNB 染料、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等,使用时只需要加入引物、模板即可进行核酸恒温扩增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依赖于 RNA 模板的聚合酶活性(逆转录),还具有依赖于 DNA 的聚合酶活性,因此无论 DNA 或 RNA 样本均可使用该制品进行高效的恒温扩增。该制品是进行 LAMP 及 RT-LAMP 扩增反应的试剂。优化的反应体系,确保快速的完成检测试剂的反应体系建立。在 LAMP 扩增起始前 HNB 染料与 Mg2+结合表现出肉眼可见的紫罗兰色,当阳性扩增发生时 Mg2+被 LAMP反应的副产物焦磷酸螯合,HNB 染料无法与 Mg2+结合表现出肉眼可见的天蓝色。由此判断天蓝色为阳性扩增。该显色方法受样本缓冲盐、pH 等影响较小,适用的样本较pH 显色法通用性更强。
储存:-20℃保存 2 年;室温(25℃)保存>6 个月。使用冻干微球进行全扩增体系用品的制备方法:将优化的扩增引物分装于 0.2 ml EP 管底部,于 70-80℃条件烘干1-2h。烘干后的 0.2 ml EP 管已经含有干燥的扩增引物,再加入一粒冻干微球即可制备成全扩增体系干燥品,该干燥品无需冷链运输,可长期保存。
反应体系说明:每一个冻干微球为按照 25 μl 反应体系建立,在使用时只需要加入 25 μl 的 ddH2O 或模板即可进行反应。
使用实例:
1. 配制反应体系
在 0.2 ml EP 反应管中加入下述试剂
Bst4.0 HNB Bead 1 粒
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到液体总量 25 μl
10xLAMP Primer Mix
浓度:FIP/BIP 分别为 16 μM、LoopF/B 分别为 8 μM、F3/B3 分别为 2 μM
2. 反应体系配好后,置于65°C进行反应25~45min。肉眼观察结果,天蓝色为阳性,紫罗兰色为阴性。
PCR 反应需要使用哪些试剂和设备?
试剂:
模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物;
设备:
PCR仪:用于控制反应温度,保证PCR反应时不同温度环节的严格控制;电泳槽:用于分离PCR扩增产物;核酸提取仪:从组织样本中全自动提取核酸。 这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是,只有在有序齐全的基础上,才能进行PCR反应并得出准确结果。
PCR相关基础实验:
PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:
一、变性:
利用高温(93-98℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。
二、退火或称接合,复性:
在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。
三、延伸:
DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。
PCR反应条件优化:
1、变性温度和时间:
保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s,再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,小于1kb, 1min足够;大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意,延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%,因此不管模板浓度是多少,20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多,非特异扩增增加。
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