单体亲和素磁珠

商品属性：

亲和素（或链霉亲和素）和生物su之间表现的相互作用，是已知的非共价相互作用最高的一种。亲和素、链霉亲和素、 单体亲和素及其类似物已成为探针研究实验中强大的亲和配体工具，被广泛应用于生化分析、诊断、亲和纯化和药物递送。Monomer Avidin Magnetic Beads是一种高度均匀的超顺磁性微球，表面包裹着高密度的超纯（>97%）亚单位单体亲和素。单体亲和素源自天然四聚体蛋白，它保留了与天然亲和素相同的生物su结合特异性，但其生物su结合亲和力会有显著降低（kD=~10-8 M）。因此，通过使用温和的洗脱条件，例如含有2 mM 生物su的缓冲液，就可以很容易地从单体亲和素中洗脱结合的生物su化分子。本款磁珠经过专门设计、测试和质量控制，可用于免疫沉淀、细胞分选，以及从细胞裂 解液或杂交反应中快速一步捕获生物su化分子，如DNA、RNA、抗体或蛋白质。

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产品特点：

·快捷，简单的一步法高通量操作;无需纯化柱或过滤器，或重复移液、离心等操作

（图1）

·结合能力，在温和的条件下洗脱结合的生物su化分子

·在温和的洗脱条件下纯化生物su化样品

·极小的非特异性结合

·对样本体积要求低，便于自动化操作

·成本低：只有市场同类产品磁珠价格的一半

·磁珠至少可以重复使用5次

缓冲液

·1x PBS Buffer (0.1 M 磷酸钠, 0.15 M 氯化钠; pH 7 ) ·1x Regeneration Buffer (0.1 M Glycine/HCl,pH 2.8) ·1x Blocking/Elution Buffer (2 mM D-生物su溶于 PBS)

磁力分离器（适用于手动操作）：根据实验时生物样品的体积，使用者可以选择以下不同型号的磁力分离器： 8 孔磁力架可以容纳 8 个单独的 1.5-2.0 ml 离心管 ; 24

孔磁力架可以容纳 24 个单独的 1.5-2.0 ml 离心管; 4 孔磁力-15 可以容纳 4 个单独的15ml 离心管; 4 孔磁力架-50 可以容纳四个单独的 50 ml 离心管。

操作过程

操作过程中实验体积可根据需要放大或者缩小

提示：在纯化生物su化蛋白质、多肽和其他分子之前。用户应将试剂盒中的所有试剂温度 平衡至室温，并用双蒸馏水配制 1x 工作溶液。

1. 轻轻震动装有磁珠的试剂瓶，直到磁珠悬浮。将 50µl 磁珠转移到新试管中。

提示：客户应根据每个实验粗样品中生物su化分子的数量，根据经验确定最佳的磁珠

使用量。过多的磁珠会导致背景更高；磁珠使用量少会造成产量降低。我们建议纯化50μg 生物su化分子添加 50μl 悬浮的磁珠。

2. 将试管放在磁力分离器上1 分钟。当磁珠沉淀时，去除上清液。取下试管加入四倍 磁珠体积的d2H2O，充分混合。并将试管再次置于磁力分离器上1 分钟，去除上清 液。

3. 按照步骤2 所述方式，用四倍磁珠体积的1x PBS 缓冲液清洗磁珠。

4. 加入三倍磁珠体积的1xBlocking / Elution Buffer，通过涡旋充分混合，并在室温下培养5 分钟。将试管放在磁力分离器上1 分钟。去除上清液。

5. 加入六倍磁珠体积的1xRegenerationBuffer，通过涡漩充分混合，并将试管放在磁力分离 器上1 分钟。去除上清液。

6. 加入四倍磁珠体积的1x PBS Buffer，并按照步骤2 所述方式清洗磁珠。这些磁珠可以随时使用。

提示：必须立即使用磁珠，否则粘合能力将显著降低。

7. 向磁珠中加入含有生物su化分子的样品，通过移液器吹吸充分混合，并在室温下缓慢旋转培养30-60 分钟。

8. 将试管放在磁力分离器上，保持试管留在分离器上的同时去除上清液。如步骤 2 所示， 用1x PBS 清洗磁珠，直到在280 nm 处洗脱液的吸光度接近背景水平（OD280<0.05）。

9. 加入一倍磁珠体积的Blocking/Elution Buffer，通过移液器吹吸充分混合，并在室温下培养 5-10 分钟，将与磁珠结合的生物su化分子洗脱下来。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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