1×Taq PCR MasterMix(purple)公司正在出售的产品:人非小细胞肺癌细胞耐细胞 KDELC2蛋白封闭多肽 禽类支原体通用PCR检测试剂盒 大鼠抗血小板抗体IgG/M/A(PA-IgG/M/A)ELISA Kit 半纤维含量活性比色法检测试剂盒 蔷薇盾壳霉 短粗矮胖19蛋白样1抗体
更新时间:2024-01-12
商品属性:
产品名称 | 规格 | 货号 |
1×Taq PCR MasterMix(purple) | 1ml | A-Hc2071 |
PCR基本步骤及注意事项?
一、实验原理
PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
二、主要的成分
1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。
注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。
2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。
PCR实验中应该注意的问题有哪些?
没有ct值
检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:
1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);
2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;
4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;
5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
ct值过晚
在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;
2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);
3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
公司正在出售的产品:
犬副流感病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒 | 蛋白脂质蛋白抗体ELISA试剂盒 PLP免费代测试剂 | 溶藻弧菌染料法荧光定量PCR试剂盒 |
薄荷染料法PCR鉴定试剂盒 | 补体调节蛋白ELISA试剂盒 CCP免费代测试剂 | 人鼻病毒29PCR检测试剂盒直销 |
乙型脊髓灰质炎病毒PCR检测试剂盒 | CopineⅧ蛋白ELISA试剂盒 | 绵羊腺病毒PCR检测试剂盒 |
埃立克体PCR检测试剂盒 | 苍白蛋白ELISA试剂盒 | 绵羊星状病毒1型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒 |
路路通探针法PCR鉴定试剂盒 | 催乳受体ELISA试剂盒 | 荚膜阿耶罗菌探针法荧光定量PCR试剂盒 |
青木香探针法PCR鉴定试剂盒 | #NAME? | 猪链球菌PCR检测试剂盒 |
球孢子菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒 | 蛋白激D2ELISA试剂盒 | 牛丘疹性口炎病毒染料法荧光定量PCR试剂盒 |
漏斗状带绦虫PCR检测试剂盒 | 蛋白体亚基β6ELISA试剂盒 | 络石藤染料法PCR鉴定试剂盒 |
流感病毒N8亚型PCR检测试剂盒(荧光PCR法) | 淀粉状蛋白βELISA试剂盒 | 奈瑟菌通用PCR检测试剂盒价格 |
禽肾炎病毒通用PCR检测试剂盒 | 多肽-N-乙酰氨基半乳糖转移12ELISA试剂盒 | 绵羊疱疹病毒型PCR检测试剂盒 |
口腔支原体PCR检测试剂盒供应 | 人谷氨脱羧自身抗体IgG(GAD-Ab-IgG)检测试剂盒elisa | 牛疱疹病毒通用PCR检测试剂盒供应 |
腔阔盘吸虫PCR检测试剂盒 | 人血管紧张Ⅱ受体1(ANGⅡR-1)试剂盒ELISA | 小茴香染料法PCR鉴定试剂盒 |
安氏网尾线虫探针法荧光定量PCR试剂盒 | 人二氢嘧啶脱氢[NADP+](DPYD)ELISA试剂盒 | 鸡疟原虫探针法荧光定量PCR试剂盒 |
卡氏住白细胞原虫探针法荧光定量PCR试剂盒 | 人REST协阻抑因子3(RCOR3)试剂盒 ELISA | 1×Taq PCR MasterMix(purple)鹅疏螺旋体探针法荧光定量PCR试剂盒 |
玉米T PCR检测试剂盒 | 人胞浆免疫球蛋白(CIg) ELISA检测试剂盒 | 牛肾盂肾炎棒杆菌PCR检测试剂盒 |