组织 / 细胞基因组 DNA 快速提取试剂盒

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

保存条件：本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。

产品介绍：
结合液/蛋白酶 K 迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组 DNA 在 高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的 步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲 液将纯净基因组 DNA 从硅基质膜上洗脱。
产品特点：
1.重复性好:离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280 典型的比值达 1.7～1.9，长度可达 30kb -50kb，可直接用于 PCR，Southern-blot 和各种酶切反应。
注意事项：
1.结合液 CB 或者抑制物去除液 IR 低温时可能出现析出和沉淀，可以在 37℃水浴几分 钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

 2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化。
 3.结合液 CB 和抑制物去除液 IR 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4.洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱， 但应该确保批 pH 大于 7.5，pH 过低影响洗脱效率。用水洗脱 DNA 应该保存在-20℃。 DNA 如果需要长期保存，可以用 TE 缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是 EDTA 可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
自备试剂：无水乙醇、1xPBS 缓冲液、RNase A（10mg/ml）（RNase A(10 mg/ml) 有售）。
操作步骤：
提示：第一次使用前请先在漂洗液 WB 中加入定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
如果需要去除 RNA，可在加蛋白酶 K 溶液前先加入 4μl RNaseA（10mg/ml）溶液振荡 15sec，室温放置 5 min

1.组织培养细胞
a. 收集约 105-10
6悬浮细胞到一个 1.5ml 离心管；对于贴壁细胞，应该先用胰蛋白消化后吹打下来收集。
b. 12,000rpm 离心 10 sec，使细胞沉淀下来。弃上清，留下细胞团和大约 10-20μl残留的液体。
c. 加 200μl 1×PBS 重悬洗涤细胞，12,000rpm 离心 10 sec，使细胞沉淀下来。弃上清, 将细胞沉淀重悬于 180μl 1XPBS 中。
d. 加入 20μl 蛋白酶 K (20mg/ml)溶液，充分混匀（可选步骤：为清除 RNA，加入 5µl RNase A（10mg/ml），振荡混匀，可选择室温放置 5min），再加入 200μl结合液 CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在 70℃放置 10 min。
e. 冷却后入 200μl 无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
f. 将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm 离心 1 min，倒掉收集管中的废液。
g. 按操作步骤 4 继续后续的实验。
2.动植物组织（例如鼠肝脑或者植物叶片）
a. 新鲜或者解冻的组织在液氮中研磨成细粉后或者用解剖切成小碎块（切成微块可以提高产量）后取 20-50mg，转入装有 180μl 组织裂解液 TL 的 1.5ml 离心管中， 用大口径枪头吹打混匀。
b. 加入 20μl 的蛋白酶 K 溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。
c. 将裂解物放置在 55℃水浴 1-3 小时或者直到组织消化全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。为清除 RNA，加入 5µl RNase A（10mg/ml），振荡混匀（可选择室温放置 5 min）。
d. 加入 200μl 结合液 CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置 10 min。
e. 冷却后加入 200μl 无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
f. 用 1ml 的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm 离心 1 min，倒掉收集管中的废液。
g. 按操作步骤 4 继续后续的实验。
3.动物组织（鼠尾）
a.将 0.2-0.5cm 的鼠尾巴尖(即 20-50mg)剪碎（一定要剪 0-2cm 范围内的尾巴尖，否则裂解效果不好），或者在液氮中研磨组织成细粉后，转入装有 180μl 组织裂解液 TL 的 1.5ml 离心管中， 用大口径枪头吹打混匀。
b.加入 20μl 的蛋白酶 K(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。
c.将裂解物放置在 55℃水浴 3 小时或者直到组织消化全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。为清除 RNA，加入 5µl RNase A（10mg/ml），振荡混匀（可选择室温放置 5 min）。
d.用一个 1ml 不带针头的一次性输液抽打裂解物 2-3 次。
e.加入 200μl 结合液 CB 和 200μl 无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。
f.12,000rpm 离心 5 min，将上清加入一个吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm 离心 30-60 sec，倒掉收集管中的废液。
g.按操作步骤 4 继续后续的实验。
4.加入 500μl 抑制物去除液 IR，12,000rpm 离心 30 sec，弃废液。
5.加入 500μl 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心 30 sec，弃掉废液。
6.重复操作步骤 5。
7.将吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000rpm 离心 2 min，将吸附柱置于室温放置数分钟，以晾干吸附材料中残余的漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
8. 取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 50-100 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65℃水浴中预热效果更好），室温放置 3-5 min，12,000rpm 离心 1 min。为了增加基因组 DNA的得率，将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置 2 min，12,000rpm 离心 1 min。(注意: DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA降解。)

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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