pCold-SUMO-10His原核蛋白表达试剂盒

商品属性：

描述：本试剂盒所包含的原核表达载体(pCold-SUMO-10His)是在 pCold-SUMO 载体基础上改造而成，

该载体启动子(CS Promoter)来源于南极嗜冷细菌，在低温下(15 度)才能启动蛋白的表达。低温下细菌生长缓慢，使得蛋白合成速度减慢，从而最大限度的提高了蛋白正确折叠的几率，提高了蛋白可溶性表达，增强了活性蛋白的表达比率。该表达系统所包含的 SUMO tag 可以极大地提高小分子量蛋白的表达量，而且进一步提高了蛋白的可溶表达几率。同时，TEE 信号肽可增强冷启动子调控下目的蛋白的高表达。
改进后的 pCold-SUMO-10His 载体，其 SUMO 蛋白标签含有 10 个组氨标签（10His tag），使其结合 Ni-NTA 的能力更强。与较早版本的 pCold-SUMO 表达系统相比，pCold-SUMO-10His 表达系统在保留了原有统的蛋白可溶性能生产能力、高特异性剪切能力的情况下，对 Ni-NTA 结合能力的得到明显提高。其对 Ni-NTA 结合能力的提高，

在以下三个方面改善了生产重组蛋白的性能：

（1）提高了粗蛋白样品中目标蛋白的捕获能力，从而提高纯化产量；

（2）在蛋白纯化过程中可以
使用更高浓度的咪唑进行漂洗，去杂蛋白的能力明显提升，从而获得更高纯度的重组蛋白；

（3）在重组蛋白酶切去除 SUMO标签后，利用 Ni-NTA 去除 SUMO 标签更为，获得纯度更高的无标签目标蛋白。
关于宿主菌的使用：本试剂盒配备了两种宿主表达菌感受态细胞，Lyophilized Arctic (DE3)感受态和 LyophilizedBL21(DE3) Chaprone 感受态，两种感受态均为冻干品形式可长期保存在-20℃，效价无明显下降（2~10X10e5 cfu/μg）。
通常在质粒载体的构建完成，并测序验证后，可将重组质粒转入该感受态进行蛋白表达。该宿主菌仅为蛋白表达生产用，不可以进行载体构建和质粒的提取制备。由于 pCold-SUMO 系统的高可溶性表达特性，在大多数情况下重组蛋白在 LyophilizedArctic (DE3)感受态即可获得理想的可溶表达，因此实验请选用 Lyophilized Arctic (DE3)感受态宿主菌。

在 LyophilizedArctic (DE3)感受态宿主菌可溶表达效果不理想的情况下，再选用操作相对复杂的、带有辅助折叠伴侣分子的 LyophilizedBL21(DE3)Chaprone 宿主菌，该系统可获得最佳的可溶表达。除此外，pCold-SUMO 系统在常规 BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌内均可获得可观的可溶性表达。
关于蛋白酶的使用：试剂盒配备了 SUMO 蛋白酶（酵母来源，也称为 UIP 蛋白酶）和 rTEV 蛋白酶，在第一步载体构建过程中需要评估、考虑两个蛋白酶的使用策略。SUMO 蛋白酶识别蛋白结构，切割活性高、酶切，对于需要去除 Tag的重组蛋白其是。个别情况下 SUMO 标签的结构会受到 C 端重组目标蛋白的影响，使得 SUMO 蛋白酶对重组融合蛋白的切割效率降低、甚至是无效，此时再选用 rTEV 蛋白酶进行酶切。由于 rTEV 蛋白酶识别氨基酸序列，个别重组融合蛋白会包埋识别序列，因此也会导致蛋白酶切效率下降。由于重组融合蛋白结构的无法预测性，因此在实验过程中两种蛋白酶的酶切均需要测试。无论如何，通常 SUMO 蛋白酶具有更高的效率。本试剂盒配备的 SUMO 蛋白酶可以识别 SUMO标签结构（SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG）切割位点位于 QIGG 之后。SUMO 蛋白酶含有双 His 标签，保证了 SUMO 蛋白酶高亲力的结合 Ni-NTA，以最大限度的去除 SUMO 蛋白酶（分子量约 26kD）。rTEV 蛋白酶可以识别 SUMO 标签后面的 Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列，并在识别位点 Gln-Gly(QG)之间进行切割，从而去除 SUMO 标签。rTEV 蛋白酶含有 6XHis 标签（分子量约 30kD），可使用 Ni-NTA 纯化介质去除。
本试剂盒配备的 pCold-SUMO-10His-Positive Plasmid 为蛋白表达阳性质粒，该质粒含有 43kD 的目标蛋白，其与SUMO 标签（19kD）融合后分子量约为 62kD。该表达质粒在 Arctic (DE3)中即可获得良好的表达。其可以仅可做为表达、酶切实验的阳性对照品。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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