大肠杆菌蛋白提取液

商品属性：

描述：生产的大肠杆菌蛋白提取液采用的中性裂解 配方，从而最大限度的提高了后续提取蛋白的活性。使用该 溶液从大肠杆菌中提取蛋白不需要超声波破碎等复杂的操 作步骤，溶液置于 4°C 可长期保存，使用方便。该溶液室温 30min 可破碎 95％以上的细胞，裂解后的溶液可直接通过 Ni-NTA 等纯化填料进行蛋白纯化。该溶液既可适用于小量 蛋白表达检测，也适用于大量蛋白的表达纯化试验；既适用 于纯化可溶型蛋白，也适用于纯化包涵体蛋白。
主要特征
♦ 单组分溶液，使用方便
♦ 裂解迅速，蛋白不会变性
♦ 适用于小量或大规模蛋白表达
♦ 适用于可溶性蛋白和包涵体纯化
应用：大肠杆菌的裂解和包涵体纯化。
储存：置于 4°C 可保存 2 年。
操作方法
♦ 可溶型蛋白操作方法（1 ml 菌液为例）
1. 8,000rpm 室温离心 3min 后，弃上层培养基，留取管底部菌体（尽量弃除掉培养基）。
2. 加入 200 μl（重悬体积不得少于 50 μl）大肠杆菌蛋白提取液重悬菌体，用吸头吹打至无可见细胞团块。
注：为降低溶液粘度，可加入 Benzonase 核酸内切酶至 0.25U/μL；加入终浓度为 1 mg/ml 的溶菌效果更佳。
3. 置于室温孵育 30-60min，期间轻弹离心管数次以加速裂解。
4. 裂解完成后 13,000rpm 于 4℃离心 15-20min，将上清转移至新的容器中，溶液可直接进行下一步纯化或检测试验。
♦ 包涵体蛋白操作方法
5. 上述步骤 4 中，弃上清，保留沉淀组分，用 200 μl 的大肠杆菌蛋白提取液重悬沉淀。
6. 加入溶菌至终浓度 1 KU/ml，混合均匀，室温孵育 10min。
7. 加入 800 μl 的灭菌水混合均匀。
8. 13,000 rpm 室温离心 15-20min，弃上清后用 900 μl 灭菌水重悬沉淀，然后加入 200 μl 大肠杆菌蛋白提取液，混合均匀。
9. 13,000rpm 室温离心 15-20min，重复步骤 8 三至五次。
10. 将沉淀溶解于变性溶液中，进行下一步纯化或复性试验。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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