Western一抗二抗去除液

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

Western 一抗二抗去除液，用于 Western Blot 中转移了蛋白的膜的重复利用。在 Western Blot 中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测 Actin、Tubulin 等内参蛋白或检测其它蛋白进行比较。Western 一抗二抗去除液可变性已经结合的抗体，使其失活，从而将同一张膜再用于其它抗体的杂交。与其它类型的一抗二抗去除液相比，该试剂不破坏抗原，处理过程中膜上抗原不丢失，因此可重复应用的次数更多、灵敏度更高。
特征
操作简单快速不会造成抗原蛋白的损失。
储存：室温可保存 2 年。
注意：该试剂为强烈的氧化剂，实验时务必做好防护工作。
如试剂接触到皮肤，请用大量的水冲洗，并尽快就医。
操作方法
(1) 将杂交完毕的膜置入蒸馏水中，室温漂洗 5min。
(2) 漂洗结束后，弃去蒸馏水。
(3) 加入适量 Western 一抗二抗去除液（至少可覆盖膜表面），室温孵育 15min。
(4) 孵育结束后，弃去 Western 一抗二抗去除液。
(5) 加入适量蒸馏水，室温漂洗 5min×4 次；漂洗结束后弃去蒸馏水。注意：每次漂洗务必将废液倒干净。
(6) 然后进行封闭等后续操作，直至完成 Western Blot。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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