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Bst 4.0 Basic Mix(with UDG)

简要描述:

Bst 4.0 Basic Mix(with UDG)公司正在出售的产品:耐DDP鼻咽癌胞,1μg/ml 嗜铬粒B封闭多肽 同牛疱疹病毒型牛疱疹乳头炎病毒PCR检测试剂盒 大鼠尿激型纤溶原激活物(uPA)ELISA检测试剂盒 还原型谷肽(GSH)活性比色法检测试剂盒 烂泥假单胞菌 MYC结合蛋白2抗体

更新时间:2024-01-12

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Bst 4.0 Basic Mix(with UDG)

商品属性:

产品名称

规格

货号

Bst 4.0 Basic Mix(with UDG)

100T

A-PJ1013

Bst 4.0 Basic Mix(with UDG)

2000Tx25μl

A-PJ1013

QQ截图20240110094643.jpg


该制品为双组分的试剂,Basic Buffer Mix 包含了反应缓冲液、Mg2+、dU/A/C/GTP(不含 dTTP)、冻干赋形剂,酶 Mix 包含 Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶、热敏 UDG。得益于 Bst 4.0 识别 dUTP 底物,反应底物中不包含dTTP,因此扩增产物均为 dUTP 产物,在配合热敏 UDG的情况下,实现防污染性能。在实际测试中,含有 10e5Copies 的污染物的条件下,抑制污染扩增。本制品尤其适用于开盖的 LAMP 反应(如试纸条检测)、密封腔体(污染风险较高)的检测试验(如定量 PCR腔体)。
试剂使用特点:
(1)Basic Buffer Mix 中不含染料,可自行添加 SYBR Green、Eva Green 等染料进行荧光检测。
(2)本试剂适用于开盖检测如核酸试纸条检测。
(3)试剂中含有冻干赋形剂,试剂可直接冻干,无需再优化冻干配方。
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储存:-20℃保存 1 年;-80℃保存 2 年;短期使用放置于2-8℃,保存 1 个月。反复冻融 10 次,不影响使用。如有白色沉淀,于 37℃水浴放置 10min 后溶解沉淀,不影响使用。
使用方法:
1. 配制 LAMP 反应体系
2.5xBst4.0 Basic BufferMix 10 μl
25xBst4.0/UDG Enzyme 1 μl
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到总体积 25 μl
10xLAMP Primer Mix 浓度:FIP/BIP 分别为 16 μM、LoopF/B 分别为 4~8 μM、F3/B3 分别为 2 μM。
注意:如何应用核酸试纸条进行特异性检测,可来信咨询。
2. 反应体系配好后,室温(25-37°C)放置 2min,以消化去除潜在的核酸污染,随后置于 65°C 进行反应15~30min。
试剂冻干策略(有冻干经验人员操作):
1. 配制 LAMP 冻干体系
2.5xBst4.0 Basic BufferMix 10 μl
25xBst4.0/UDG Enzyme 1 μl
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
ddH2O 到体积 1.5 μl
冻干总体积 15 μl
2. 体系配制完毕后,加入 0.2 ml EP 管进行上机冻干。该试剂的冻干体积为 15 μl, 检测反应体积为 25 μl。

特别说明:
(1)本试剂防污染原理为:热敏 UDG 消化去除含有 dUTP的扩增产物,热敏 UDG 在随后 50℃以上迅速失活,并不影响后续 LAMP 扩增。因此,本试剂无法去除采用 dTTP扩增的污染物,也不能消化天然的核酸底物(DNA/RNA)。为避免扩增气溶胶污染,实验室应长期使用本试剂进行实验,一旦使用 dTTP 试剂扩增后,造成实验室污染,采用本试剂不会消除假阳性扩增。
(2)本试剂适用基于 OG 染料变色法、SYBR Green 法、基于 Biotin/FAM 探针的核酸胶体金法( 具有胶体金法特异性使用策略,如需技术支持,请来信咨询)。本试剂不支持 HNB、pH 显色法。其它使用策略自行优化调整。
(3)基于本试剂, 提供冻干制备服务。八联管起订量 480T,冻干球起订量 2000T。

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PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

公司正在出售的产品:

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补体片断4bELISA试剂盒 C4b免费代测试剂

无齿类圆线虫染料法荧光定量PCR试剂盒

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马蛔虫探针法荧光定量PCR试剂盒

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马杜拉放线菌PCR检测试剂盒

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禽痘病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

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猫冠状病毒PCR检测试剂盒

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派琴虫通用PCR检测试剂盒

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C型凝集结构域家族4成员E(CLEC4E)试剂盒ELISA

串珠镰刀菌探针法荧光定量PCR试剂盒

弗格森艾利希体(弗格森埃立克体)探针法荧光定量PCR试剂盒

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杆菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒

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α/β干扰受体(IFN-α/βR) ELISA试剂盒

Bst 4.0 Basic Mix(with UDG)蛇形隐孢子虫探针法荧光定量PCR试剂盒

非洲猪瘟(ASFV)核检测试剂盒

人补体片段3d(C3d)试剂盒ELISA

破伤风杆菌PCR检测试剂盒