HotStart Bst 4.2 Basic Mix(可冻干)

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

描述：

2.5xBst4.2 Basic Mix 包含了 Helicaser、dNTP、Mg2+、反应缓冲盐、冻干赋形剂和稳定剂。HotStart Bst4.2DNA/RNA 聚合酶为单独的组分。本品不仅可作为常规检测试剂，对于具有冻干经验的研究者，
本品还直接进行后续冻干，无需再加入任何其它辅料。

Bst4.2 具有以下性能：
（1）Bst 4.2 全系包含热启动Aptamer，该配体确保酶在<30℃时，酶活封闭效率>95%,在>60℃时 1min 内释放酶活。该特性利于室温建立反应体系，并大幅降低了低温条件下的非特异扩增；
（2）反应温度提升到 70℃，大幅降低引物 Dimer 的形成，提高扩增特异性，并使得粗样品核酸释放更加充分；
（3）全系包含 Helicaser，因此，允许在不使用 F3/B3 引物的情况下进行 LAMP 扩增（easy LAMP），并允许 FIP/BIP 的引物用量降低一倍。这将进一步降低非特异扩增，并使得扩增均一性大幅提升。本品为多用途的试剂，适用于 LAMP 进行 MolecularBeacon 探针、DP-LAMP 探针、试纸条等检测。

储存：长期保存请置于-20℃以下（12 个月有效）；制品反复冻融10 次不影响性能，但应避免反复冻融；制品由于含有高浓度的糖组分，-20℃保存的制品，在融化时可能会有结晶物。此时 2.5xBst4.2Mix 可在 37℃进行融化，而 Bst4.2 酶制品在 30℃的温度下融化，过高的温度可能会导致热启动性能下降。一经融化推荐置于2-8℃保存，在此条件下制品稳定储存 6 个月。
特殊说明：
（1） Bst4.2 DNA/RNA Polymerase 在用于 LAMP 扩增时的推荐反应温度为 65-70℃，最佳反应温度为 70℃。因此其可替代 的 Bst4.0 系列，用于标准 LAMP 的扩增。
（2） 由于 Helicaser 的反应温度为 70℃，因此在进行 eLAMP 扩增时，反应温度为 70℃。
（3） 制品中包含高浓度的盐组分，使用时做好个人防护，防止制品与皮肤、眼、鼻、呼吸道等接触和吸入，一旦接触或吸入，请用大量的清水冲洗。
（4）防止气溶胶污染，尽可能进行分区操作。
1. 标准 LAMP 和 eLAMP 扩增的区别本试剂既可以用于标准 LAMP 扩增，也可以用于 eLAMP扩增。
1.1 10x 标准 LAMP Primer MixFIP/BIP=16 μM each; LF/LB=4 μM each; F3/B3=2 μM each
1.2 10xeLAMP Primer MixFIP/BIP=8 μM each; LF/LB=4 μM each
注意：eLAMP（easy LAMP）为去除 F3/B3 引物的方法，为 Bst4.2系列专用的使用策略，对于大多数引物组，在 Helicaser 的加持下，扩增速度几乎不受影响。如引物扩增效率低，可提高 FIP/BIP 浓度到 12~16uM。
1.3 扩增温度不同标准 LAMP 扩增 eLAMP 扩增65-70°C 均可 70°C 反应
2. 配制 LAMP 反应体系
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
10x Primer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到总体积 25 μl
反应体系配好后，置于 65-70°C 反应 20~30min。
3. 试剂的冻干反应（仅限专业人员）本试剂可供具有冻干经验的人员直接进行后续冻干，试剂的配方对冻干条件不苛刻。但对于不同的用户来讲，由于冻干形式、冻干体积、上机量、冻干容器、冻干磨具等因素存在差异，以下程序仅供参考。进一步的程序优化均需根据具体情况自行调整。对于非专业人员来讲，请直接采购  的冻干制品，或委托订制。
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
25xPrimer Mix 1 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
Total 12 μl
制品成型后的冻干程序：
-50℃预冻 10min； -50℃ 4-8h（真空段）；-50℃升温到 25℃（每小时升温 5℃）；25℃ 2h； 25℃恒温。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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