LAMP Loop DP-Probe (订制品)

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

该 DP-Probe(DisPlaceable Probe)为链置换荧光探针，专用于LAMP 的荧光扩增。Loop DP-Probe 在搭配 HotStart Bst4.2 Basic 试剂时表现出极为出色的特异性，可以大幅降低非特异性扩增。LoopDP-Probe Pair 是将 Loop 引物进行改造（LF/B 任意一条均可），其由两条标记引物退火组成：荧光猝灭引物（5’IBFQ+Tail+Loop）和荧光报告引物（Tail 互补区+3’发光基团），其不发荧光。在 LAMP反应中 Loop 引物渗入到“哑铃"结构，由扩增返回“哑铃"延伸并置换游离的荧光报告引物，累积产生荧光信号。有经验的研究人员可根据参考文献自行制备 LAMP Loop DP-Probe Pair，经验不足的人员可委托  来制备， 提供三种荧光标记的探针。需要客户提供 Loop 序列，并指明需要的荧光标记（FAM/JOE/ROX）。

eLAMP DP-Probe 试剂的开发简述
1. 引物的粗筛选
无论是变色、试纸条、荧光法 eLAMP 试剂的开发，前期的测试过程， 推荐采用价格较低的液体 HotStart Bst4.2 SYBR Green试剂（进行粗筛选。通常筛选的引物为 3-5 组。10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LF/LB=4 μM each.测试样品：10e3、100、25、10Copies/管，NTC(16-32 重复)
2.5xBst4.2 SYBR Green Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μlddH2O 到总体积 25 μl置于 70°C 反应 45min，1min 收集一次荧光信号。

良好的引物组具有 以 下 特 性 (Ct) ：

10e3copies =5-10min; 25copies <15min;10Copies<20min, NTC 均>40min. 以上实验需要反复确认，以确
保核心引物的工作效率，否则重新筛选，再进行后续的其它测试。
2. Loop DP-Probe Pair 的制备
根据上述引物组的筛选情况，选取最佳引物组。在此基础上改造LF 或 LB，改造哪一条效果更佳，必须经过测试。下面以改造 LF为例进行说明。 通常提供 25x 的 LF DP-Probe Pair（或自行制备）。

注意：

（1）测试试剂更改为 HotStart Bst4.2 Basic 试剂。

（2）10xeLAMP Mix 引物浓度有调整。
10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LB=4 μM；LF=3 μM.
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
25x LF DP-Probe Pair 1 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到总体积 25 μl
置于 70°C 反应 45min，1min 收集一次荧光信号（注意根据探针荧光标记，选取正确的荧光通道）。与 SYBR Green 结果相比来看，时间会滞后 1-3min。NTC 的控制会明显提升。

此时可进一步做后续的其它项目测试。
3. 如有试剂冻干制备的需求可采用如下几种方案：
（1）(液体试剂)+PrimerMix 自行冻干（专业人员使用）。
（2）PrimerMix+(引物冻干剂)自行冻干，加入 (冻干球)。
（3）（HotStart Bst4.2），全程自行冻干（专业人员使用）。
（4）委托  进行全体系冻干。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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