His标签纯化树脂（Ni-NTA Resin）

商品属性：

描述：

Ni-NTA Resin 是用于纯化 6×His 标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由 4%交联的 Sepharose 耦连了一种四齿螯合剂 NTA 而得. 它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的 6xHis 标签重组蛋白。NTA，含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合 Ni2+。6×His 可与 Ni2+螯合，从而使 His 标签蛋白结合在 Ni-NTA 纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低 PH 缓冲液被温和的洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。
主要特征
该纯化介质与 His 标签蛋白具有的亲和力，可达5-20 mg/ml。
可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的 His标签蛋白。
纯化程序简单，所得的蛋白纯度可高达 95％。
Ni-NTA 可再生 4-6 次，重复使用。
组成：50％的悬浮液（20％乙醇），已螯合 Ni2+。
应用
His 标签蛋白的纯化。
蛋白结构与功能研究。
蛋白-蛋白以及蛋白-DNA 之间相互作用的研究。
配体-受体之间相互作用的研究。
储存：4℃保存，可保存 2 年。
操作方法
A. 非变性条件下抽提 His 标签蛋白
1. 样品准备
1) 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的 pET 载体表达系列，在细胞 OD600=0.5-0.8 时，用 1 mM IPTG 诱导 1-3 小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70°C或立即进行步骤 2 操作。
2) 加入 1/20 细胞生长体积的 NTA-0 Buffer (20 mMTris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl,10% Glycerol)和 1 mM PMSF。
注意：PMSF 见水分解，需要在使用前加入。
3) 将细胞悬浮起来，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。
4) 加入 10% Triton X-100, 使终浓度为 0.05%，充分混匀，冰上放置 15 分钟。
5) 13,000 转/分(20,000xg 以上)，4°C 离心 15min。取上清，置于冰上备用或-20°C 保存。
2. 层析
1) 将 NTA 树脂装入合适的层析柱，层析用 10 倍 NTA 体积的 NTA-0 Buffer 平衡填料。
2) 将上清样品加至 NTA 层析柱中，流速在 15 ml/h 左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。
3) 层析用 5 倍 NTA 体积的 NTA-0 Buffer 洗涤填料，流速控制在 30 ml/h 左右。
4) 再分别用 5 倍 NTA 体积的 NTA-20、NTA-50、NTA-100、NTA-250 洗脱填料，流速控制在 15 ml/h 左右，收集洗脱液，每管收集一个 NTA 体积。
5) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是 SDS/PAGE 分析。也可以用 Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白质的分布。
6) 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
3. 溶液配方
NTA-0 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
NTA-20 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
20 mM Imidazole(咪唑)
NTA-50 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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