His标签纯化树脂(Ni-NTA Resin)公司正在出售的产品:小白鼠肺成纤维细胞 磷化丝裂原活化蛋白激磷p38γ封闭多肽 鸽疱疹病毒型PCR检测试剂盒 大鼠水通道蛋白3(AQP-3)ELISA检测试剂盒 食品中亚硝盐含量活性比色法检测试剂盒 诺尔斯链霉菌 9号染色体开放阅读框150抗体
更新时间:2024-01-12
商品属性:
产品名称 | 规格 | 货号 |
His标签纯化树脂(Ni-NTA Resin) | 20 ml (50%浆体) | A-PJ1101 |
描述:
Ni-NTA Resin 是用于纯化 6×His 标签重组蛋白的一种纯化介质,它是由 4%交联的 Sepharose 耦连了一种四齿螯合剂 NTA 而得. 它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的 6xHis 标签重组蛋白。NTA,含有四个螯合区,较一般的三齿螯合剂能更好的结合 Ni2+。6×His 可与 Ni2+螯合,从而使 His 标签蛋白结合在 Ni-NTA 纯化介质上,未结合的蛋白被洗涤下去,结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低 PH 缓冲液被温和的洗脱下来,从而得到高纯度的目的蛋白。
主要特征
该纯化介质与 His 标签蛋白具有的亲和力,可达5-20 mg/ml。
可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的 His标签蛋白。
纯化程序简单,所得的蛋白纯度可高达 95%。
Ni-NTA 可再生 4-6 次,重复使用。
组成:50%的悬浮液(20%乙醇),已螯合 Ni2+。
应用
His 标签蛋白的纯化。
蛋白结构与功能研究。
蛋白-蛋白以及蛋白-DNA 之间相互作用的研究。
配体-受体之间相互作用的研究。
储存:4℃保存,可保存 2 年。
操作方法
A. 非变性条件下抽提 His 标签蛋白
1. 样品准备
1) 准备细胞,接种,诱导表达。对于实验室用的 pET 载体表达系列,在细胞 OD600=0.5-0.8 时,用 1 mM IPTG 诱导 1-3 小时,可以获得理想的表达效率。收集细胞,置于-70°C或立即进行步骤 2 操作。
2) 加入 1/20 细胞生长体积的 NTA-0 Buffer (20 mMTris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl,10% Glycerol)和 1 mM PMSF。
注意:PMSF 见水分解,需要在使用前加入。
3) 将细胞悬浮起来,超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。
4) 加入 10% Triton X-100, 使终浓度为 0.05%,充分混匀,冰上放置 15 分钟。
5) 13,000 转/分(20,000xg 以上),4°C 离心 15min。取上清,置于冰上备用或-20°C 保存。
2. 层析
1) 将 NTA 树脂装入合适的层析柱,层析用 10 倍 NTA 体积的 NTA-0 Buffer 平衡填料。
2) 将上清样品加至 NTA 层析柱中,流速在 15 ml/h 左右,收集穿透部分,用于 SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。
3) 层析用 5 倍 NTA 体积的 NTA-0 Buffer 洗涤填料,流速控制在 30 ml/h 左右。
4) 再分别用 5 倍 NTA 体积的 NTA-20、NTA-50、NTA-100、NTA-250 洗脱填料,流速控制在 15 ml/h 左右,收集洗脱液,每管收集一个 NTA 体积。
5) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是 SDS/PAGE 分析。也可以用 Bradford 蛋白质测定试剂盒,快速确定蛋白质的含量,然后用 SDS/PAGE 分析蛋白质的分布。
6) 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
3. 溶液配方
NTA-0 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
NTA-20 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
20 mM Imidazole(咪唑)
NTA-50 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
PCR基本步骤及注意事项?
一、实验原理
PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
二、主要的成分
1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。
注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。
2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。
PCR实验中应该注意的问题有哪些?
没有ct值
检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:
1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);
2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;
4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;
5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
ct值过晚
在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;
2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);
3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
公司正在出售的产品:
悉尼马尔太虫染料法荧光定量PCR试剂盒 | 吖啶橙ELISA试剂盒 AO免费代测试剂 | 布鲁氏杆菌(bcsp31基因)探针法荧光定量PCR试剂盒 |
鲤疱疹病毒3型PCR检测试剂盒供应 | 蛋白激C beta IIELISA试剂盒 PKC-bII免费代测试剂 | 诺如病毒3型PCR检测试剂盒供应 |
肉毒杆菌B型(CB-B)核检测试剂盒 | 胱抑BELISA试剂盒 | 马类圆线虫PCR检测试剂盒 |
卡氏肺胞子虫PCR检测试剂盒 | 蛋白酪氨磷样蛋白AELISA试剂盒 | 马克洛菌染料法荧光定量PCR试剂盒 |
猫免疫缺陷病毒染料法荧光定量PCR试剂盒 | 毒蕈碱型受体M4ELISA试剂盒 | 施氏油脂线虫探针法荧光定量PCR试剂盒 |
葡萄孢菌染料法荧光定量PCR试剂盒 | 多聚ADP核糖聚合4ELISA试剂盒 | 牡蛎疱疹病毒(OsHV)核检测试剂盒 |
葡萄糖苷曼氏杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒 | 耳胶蛋白ELISA试剂盒 | 禽传染性支气管炎病毒Conn型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒 |
猫弓形虫PCR检测试剂盒 | 二肽2ELISA试剂盒 | 类圆线虫通用探针法荧光定量PCR试剂盒 |
曼氏杆菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒探针法荧光定量PCR试剂盒 | 芳基硫酯AELISA试剂盒 | 诺如病毒G1型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒 |
皮诺卡菌探针法荧光定量PCR试剂盒 | 肺特异性X蛋白ELISA试剂盒 | 马红球菌PCR检测试剂盒 |
流感病毒N1亚型PCR检测试剂盒(荧光PCR法) | 人蛋白C(PC)检测试剂盒elisa | 禽传染性喉气管炎病毒(AiLTV)PCR检测试剂盒(荧光-PCR法) |
牛副结核分枝杆菌PCR检测试剂盒(荧光PCR法) | 人纤维母细胞表面抗原(FSP)试剂盒ELISA | 组链球菌染料法荧光定量PCR试剂盒 |
肠道病毒通用探针法荧光定量RT-PCR试剂盒,停 | 人鼻病毒(RV)抗体(IgA)ELISA试剂盒 | 米黑根毛霉探针法荧光定量PCR试剂盒 |
人分枝杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒 | 人β内酰胺(β-lactamase) ELISA试剂盒 | His标签纯化树脂(Ni-NTA Resin)呼吸道合胞病毒和腺病毒PCR检测试剂盒(荧光PCR法) |
寨卡(zika)病毒核检测试剂盒 | 人促生长激释放激(GHRH)ELISA试剂盒 | 禽类支原体通用PCR检测试剂盒 |