Strep-Tactin XT Resin

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

Strep-Tactin XT（Strep-Tactin 的升级产品）琼脂糖凝胶 FF 是一种将 Strep-Tactin XT 共价交联在琼脂糖凝胶微球上，形成的生物亲和层析分离介质。该纯化介质主要用于纯化 Strep tag II 或 Twin strep tag 标签蛋白。Strep tagII 标签为 8 个氨基酸的小标签（WSHPQFEK），由于标签小，仅为 1kDa 左右，一般不影响融合后蛋白质的结构和功能，常用于融合表达蛋白质的检测和纯化。由于 Strep-Tacin XT 对 Strep tag II 标签具有高度特异性，一步纯化就能获得高纯度的蛋白质样品。Strep tag II 标签蛋白与凝胶结合后可使用脱硫生物su竞争方式进行洗脱，该洗脱方式比较温和，对蛋白影响极小。由于 Strep-Tactin 对 Strep tag II 标签具有很强的吸附能力，在生物su的洗脱过程中不易洗脱，造成洗脱效率较低。可以通过在脱硫生物su洗脱液中添加 25mM NaOH 来提高蛋白回收效率，而添加 NaOH 后会造成 Strep-Tactin从填料上脱落，进而污染纯化蛋白。本产品为升级的 Strep-Tactin XT，其可耐受高浓度的 NaOH 洗脱（0.5M），除此外 Strep-Tactin XT 可耐受 1%SDS、6M 尿素，因此使用该填料可以在变性条件下纯化标签蛋白。

储存：4~8℃可保存 2 年。
保存液：10mM Tris-HCl，pH7.5；100mM NaCl；20%乙醇
实验用溶液：
(1) 结合缓冲液：根据自身蛋白性质来定，一般推荐 50mM Tris-HCl(pH8.0), 150mM NaCl（或采用 PBS）
(2) 洗涤液与结合缓冲液相同，一般洗涤 5~20 个柱体积。
(3) 洗脱缓冲液：在结合缓冲液中加入 2.5~3.5mM D-Biotin。或根据蛋白性质和用途灵活使用其它洗脱条件，如 2.5mMD-Biotin+10mM NaOH；25~50mM NaOH；0.2% SDS：
(4) 柱再生：0.2M NaOH 洗涤 3~5 个柱体积；1M NaCl 洗涤 3~5 个柱体积；PBS 平衡 3~5 个柱体积。

PCR 反应需要使用哪些试剂和设备？

试剂:
模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；
设备：
PCR仪：用于控制反应温度，保证PCR反应时不同温度环节的严格控制；电泳槽：用于分离PCR扩增产物；核酸提取仪：从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是，只有在有序齐全的基础上，才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验：

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

一、变性：

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性：

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸：

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化：

1、变性温度和时间：

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

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